Википедия биотин: Недопустимое название — Викисловарь

Области применения, для которых используется взаимодействие авидин-биотин, включают:

Как и вторичные антитела, система обнаружения авидин-биотин позволяет легко улавливать практически неограниченное количество первичных реагентов обнаружения (т. е. антител, зондов нуклеиновых кислот и лигандов). , выделенные, иммобилизованные или обнаруженные с помощью очень небольшого количества реагентов для вторичной детекции, полученных путем модификации авидина или стрептавидина.Кроме того, если конкретная биотинилированная молекула недоступна, существует множество коммерчески доступных реагентов для облегчения биотинилирования в лаборатории. Точно так же авидин и стрептавидин также могут быть модифицированы по мере необходимости.

Иммуногистохимический анализ. Обнаружение GAPDH и цитокератина 18 в карциноме толстой кишки человека с высокой чувствительностью NeutrAvidin-HRP Pierce High Sensitivity NeutrAvidin-HRP Conjugate

Технический справочник по авидин-биотину

В нашем 48-страничном техническом справочнике по авидину-биотину собрано все необходимое для биотинилирования, очистки или обнаружения белков.Рекомендуемые продукты включают наборы для биотинилирования и очистки белков клеточной поверхности, мечение антител и новые фотореактивные реагенты для биотинилирования. Это руководство включает в себя десятки ссылок, а также протоколы, советы по устранению неполадок, руководства по выбору и полный список доступных инструментов.

Недостатки использования системы авидин-биотин

Хотя система авидин-биотин проста в настройке и использовании, она имеет определенные ограничения. Поскольку любая биотинилированная молекула будет связываться с любым биотинсвязывающим белком, эти реагенты необходимо использовать в сочетании с другими системами обнаружения-зонда (т.е., первично-вторичные антитела) для мультиплексных экспериментов.

Кроме того, поскольку биотин является биологической молекулой, эндогенный биотин может вызвать проблемы с фоном и специфичностью при выполнении анализов с некоторыми богатыми биотином тканями и экстрактами (например, мозг, печень, молоко, яйца, кукуруза). Это также относится к образцам, содержащим эндогенные биотинсвязывающие белки, такие как яйца (источник авидина) или бактерии, такие как Streptomyces avidinii (источник стрептавидина).

Химическая структура HNS-дестиобиотина. Обратите внимание на модифицированную кольцевую структуру справа (натуральный биотин имеет двойную кольцевую структуру, которая соответствует сайту связывания авидина, стрептавидина или нейтравидина).

При очистке сила связывающего взаимодействия между биотином и авидином является фактором, ограничивающим его применимость. Это связано с тем, что для разрыва связей авидин-биотин (т. е. для диссоциации и элюирования) требуются суровые условия, которые могут денатурировать белки-мишени. Чтобы преодолеть это ограничение, коммерчески доступны модифицированные версии авидиновых смол и модифицированные формы реагентов для мечения биотина, которые делают взаимодействие легко обратимым.К ним относятся мономерный авидин, расщепляемые дисульфидные биотиновые реагенты и производные иминобиотина и дестиобиотина (см. обсуждение выделения и обогащения белка ниже).

Биотин и биотинсвязывающие белки

Биотин

Биотин представляет собой витамин (витамин H, витамин B7, кофермент R), который присутствует в небольших количествах во всех живых клетках и имеет решающее значение для ряда биологических процессов, включая рост клеток и цикл лимонной кислоты. Биотин в изобилии содержится в некоторых тканях растений и животных, таких как зерна кукурузы, яичный желток, мозг, печень и кровь.Боковая цепь валериановой кислоты молекулы биотина может быть дериватизирована для включения различных реакционноспособных групп, которые облегчают добавление биотиновой метки к другим молекулам. Поскольку биотин относительно мал (244,3 дальтона), его можно конъюгировать со многими белками и другими молекулами без существенного изменения их биологической активности. Высокоспецифичное взаимодействие биотин-связывающих белков с биотином делает его полезным инструментом в системах анализа, предназначенных для обнаружения и нацеливания биологических аналитов.

Химическая структура биотина. Биотин, также известный как витамин B7 (ранее витамин H и кофермент R), растворим в воде. Молекула состоит из кольца уреидо, соединенного с кольцом тетрагидротиофена. Биотин является коферментом для ферментов карбоксилазы, и биотин необходим для синтеза этих молекул: жирных кислот, изолейцина и валина. Биотин также участвует в глюконеогенезе.

После присоединения биотина к молекуле биотиновую метку можно использовать для облегчения аффинной очистки этой молекулы с использованием иммобилизованного биотин-связывающего белка.В качестве альтернативы биотинилированная молекула может быть иммобилизована посредством взаимодействия с биотин-связывающим белком, а затем использована для аффинной очистки других молекул, которые специфически взаимодействуют с ней (т. В контексте иммуногистохимии и иммуноблоттинга биотин чаще всего конъюгируют с первичными или вторичными антителами, а биотиновую метку затем обнаруживают с помощью биотин-связывающего белка, который конъюгирован с ферментом, флуорофором или другой репортерной молекулой.Многие белки, такие как антитела, могут быть помечены несколькими биотиновыми метками, каждая из которых способна связываться с биотин-связывающим белком. Оптимизированное соотношение биотина и зонда может значительно увеличить выходной сигнал системы обнаружения, что делает возможным создание очень чувствительных анализов.

Антитела и другие молекулы, меченные биотином, легко доступны у коммерческих поставщиков, что делает разработку анализов рутинной для многих приложений. Для анализов, в которых биотинилированный зонд недоступен, существует множество реагентов для биотинилирования, которые позволяют исследователям химически метить белки, нуклеиновые кислоты и поверхностные материалы для изготовления пользовательских реагентов для анализа.

Авидин

Авидин представляет собой биотинсвязывающий белок, который, как считается, действует как антибиотик в яйцах птиц, рептилий и амфибий. Куриный авидин имеет массу 67 000-68 000 дальтон и состоит из четырех субъединиц по 128 аминокислот, каждая из которых связывает одну молекулу биотина. Авидин сильно гликозилирован, около 10 % его общей массы составляют углеводы, что способствует его базовой изоэлектрической точке (pI) 10-10,5 и высокой растворимости в воде и водных растворах солей.Поскольку авидин легко очищается из белков куриных яиц, его производство очень экономично (гораздо более экономично, чем стрептавидин).

Авидин обладает очень высоким сродством к четырем молекулам биотина, стабилен и функционален в широком диапазоне pH и температуры. Авидин поддается обширной химической модификации практически без влияния на функцию, что делает его полезным для обнаружения и очистки белков биотинилированных молекул в различных условиях. Специфическое взаимодействие авидина с биотином делает его полезным инструментом для разработки нерадиоактивных систем обнаружения с превосходной чувствительностью. Содержание углеводов и базовая pI авидина могут привести к высокому уровню неспецифического связывания, поэтому для получения наилучших результатов анализа при его использовании требуется тщательная оптимизация условий блокирования и промывки.

Стрептавидин

Стрептавидин представляет собой тетрамерный биотинсвязывающий белок, выделенный из Streptomyces avidinii и имеющий массу 60 000 дальтон. Хотя авидин и стрептавидин имеют очень небольшую гомологию аминокислот, их структуры очень похожи.Как и авидин, считается, что стрептавидин действует как антибиотик и имеет очень высокое сродство к биотину (K _d  = 10 ^{от -14 до -15} М). В отличие от авидина, стрептавидин не содержит углеводов и имеет кислую изоэлектрическую точку (pI = 5), что придает стрептавидину значительно более низкую растворимость, чем авидин. Коммерчески доступные продукты стрептавидина, например стрептавидин Thermo Scientific Pierce, могут представлять собой рекомбинантную форму стрептавидина с массой 53000 дальтон и почти нейтральной изоэлектрической точкой (pI = 6. 8-7,5).

Отсутствие гликозилирования стрептавидина и более низкий pI приводит к более низкой степени неспецифического связывания, особенно связывания с лектинами, по сравнению со степенью, наблюдаемой для авидина в иммуногистохимических применениях. Это делает стрептавидин идеальным реагентом для многих систем обнаружения. Стрептавидин содержит последовательность узнавания бактерий, называемую мотивом RYD, которая аналогична мотиву RGD млекопитающих и может связываться с рецепторами клеточной поверхности, вызывая фоновый сигнал в некоторых пробах для анализа.Кроме того, как нативный, так и рекомбинантный стрептавидин более дороги в производстве, что делает их более дорогостоящими, чем реагенты для анализа на основе авидина.

Дегликозилированный авидин (нейтравидин)

Как авидин, так и стрептавидин имеют свои преимущества и недостатки. Ключевыми преимуществами авидина являются низкая стоимость производства и очень высокая растворимость, а ключевыми недостатками — высокий pI и высокая склонность к неспецифическим взаимодействиям и связыванию с лектинами. Стрептавидин имеет более низкое неспецифическое связывание и почти нейтральный pI.Однако производство стрептавидина обходится дороже, а последовательность RYG действительно создает проблемы специфичности в некоторых приложениях. Гораздо более идеальный реагент не имел бы проблем с неспецифическим связыванием авидина или стрептавидина, имел бы почти нейтральный pI и был бы рентабельным в производстве. Это достигается с помощью дегликозилированного авидина.

Дегликозилированный авидин, коммерчески доступный как NeutrAvidin Protein от Thermo Scientific, лишен основных недостатков как нативного авидина, так и стрептавидина.Белок NeutrAvidin (60 000 дальтон) имеет уменьшенную массу по сравнению с авидином (67 000 дальтон) и сохраняет свою высокую биотинсвязывающую способность. Дегликозилирование авидина снижает связывание лектина до неопределяемого уровня, а дальнейшая модификация снижает изоэлектрическую точку (pI=6,3), эффективно устраняя основные причины неспецифического связывания авидина. Поскольку остатки лизина остаются доступными, белок NeutrAvidin может быть дериватизирован или конъюгирован так же легко, как и стрептавидин, но в нем отсутствует последовательность RYD, которая может вызывать неспецифическое связывание в анализах IHC.Вместе высокая аффинность связывания биотина и низкое неспецифическое связывание делают белок NeutrAvidin наиболее идеальным белком, связывающим биотин.

Сравнение белков, связывающих биотин.

9012 Avidin (цыпленок) 1	Streptavidin (рекомбинантный)	Neutravidin (от Avidin)
Молекулярный вес (KDA)	67	53	60121	60121	60121
сайты Biotin-Binding	4	4	4	4
IseEletricic Point (PI)	10	6. 8 до 7.5	6.3	6.3	6.3
Специфика	Low	Высокий	самый высокий
сродство для биотина (K D )	~ 0,04 x10 -15 м	~ 1,3 x 10 -15 M
Nonspecific Binding	Высокий	Низкий	самый низкий *

* В зависимости от применения или обстоятельств

Применение авидин-биотиновых зондов

Система авидин-биотин может использоваться для многочисленных лабораторных методов.Наиболее распространенные методы используют авидин или стрептавидин для обнаружения биотинилированных зондов. Ниже приводится обзор некоторых основных лабораторных методов, эффективно использующих эту систему.

Обнаружение белков

Обнаружение белков является основным лабораторным методом, используемым для мониторинга очистки белков, производства, уровней экспрессии и т. д. Поскольку большинство белков трудно отличить от других белков в сложном образце, используются антитела и другие специфические зонды. для облегчения непрямого обнаружения специфических белков.Используя системы авидин-биотин, биотинилированные первичные или вторичные антитела можно обнаружить с помощью биотин-связывающего белка, конъюгированного либо с флуоресцентными, либо с ферментативными реагентами для обнаружения. Общие анализы, использующие этот формат, включают IHC, вестерн-блоттинг и ELISA.

Основным преимуществом использования систем авидин-биотин для обнаружения белков является способность усиливать исходный белковый сигнал для улучшения обнаружения белков, экспрессируемых на низких уровнях, путем образования больших комплексов авидин-биотин, как показано на диаграмме ниже. Эти комплексы обогащают конъюгированный репортер (флуорофор или фермент) в месте антигена-мишени для большего обнаружения сигнала.

Схема усиления сигнала за счет образования комплекса авидин-биотин. Авидин, стрептавидин или белок NeutrAvidin могут связывать до четырех молекул биотина, которые обычно конъюгированы с ферментом, антителом или целевым белком с образованием комплекса авидин-биотин.

Обнаружение нуклеиновых кислот

Обнаружение нуклеиновых кислот является еще одним основным лабораторным методом, используемым для определения наличия, распространенности или изменений последовательности в определенных полинуклеотидах.В то время как многие лаборатории перешли на более быстрые формы обнаружения, такие как полимеразная цепная реакция в реальном времени (RT-PCR), также известная как количественная PCR (qPCR), нозерн- и саузерн-блоттинг остаются эффективными методами подтверждения наличия специфической ДНК и последовательности РНК, а также их размер и целостность. Хотя этот метод не такой быстрый, как методы ПЦР, он также полезен для гибридизации in situ с бактериальными колониями и бляшками бактериофагов при проведении скрининга больших клонов.В этих методах целевой нуклеотидный фрагмент переносится на промокательную мембрану и иммобилизуется на ней. После строгой процедуры блокирования целевая последовательность затем гибридизуется с биотинилированным комплементарным нуклеотидным зондом. Затем биотиновые метки могут быть локализованы и обнаружены с использованием биотинсвязывающего белка, конъюгированного с реагентом для обнаружения.

Выделение и обогащение белков

Анализы иммунопреципитации (IP) могут быть упрощены и улучшены за счет использования стратегий авидин-биотин.В некоторых процедурах антитело добавляется непосредственно в образец для анализа для инициации связывания с последующим захватом комплекса антитело-мишень с использованием агарозы с белком А или аналогичной подложки. В других процедурах антитело сначала иммобилизуют, а затем используют для захвата антигена-мишени. В любой процедуре, описанной выше, присутствие иммуноглобулинов в образце (особенно в последнем случае) может значительно снизить выделение целевого антигена и потенциально увеличить неспецифические взаимодействия.Кроме того, когда комплекс антитело-антиген захватывается из образца комплекса, для носителей, таких как белок А, может потребоваться длительное время инкубации, чтобы обеспечить достаточное время для иммобилизации антител. Эти проблемы можно устранить, используя биотинилированные первичные антитела и иммобилизованный биотинсвязывающий белок. Поскольку биотинсвязывающие белки будут связываться только с биотиновой меткой, эндогенные иммуноглобулины не являются источником беспокойства. Кроме того, из-за очень сильного сродства к биотину инкубационные периоды либо для предварительной иммобилизации антитела, либо для комплекса антитело-антиген более постоянны, и только целевая концентрация, вязкость и объем образца являются основными источниками изменчивости.Репрезентативные данные, показанные здесь, представляют собой пример эксперимента по иммунопреципитации, предназначенного для обнаружения нескольких белков.

Иммунопреципитация с использованием стрептавидина. Комплект Pierce MS-Compatible Magnetic IP Kit позволяет использовать стрептавидин и обеспечивает эффективный захват и элюирование мишени. Антитела были помечены этим набором и использованы для IP-мишени белков из клеточных лизатов. Элюции анализировали вестерн-блоттингом. Проценты ниже целевого значения указывают на эффективность элюирования по сравнению с кипячением в шариках.

Авидин-биотиновая химия делает возможными многие другие способы мелкомасштабной очистки и обогащения помимо иммунопреципитации. Например, непроницаемые для мембраны реагенты для биотинилирования можно использовать для мечения белков клеточной поверхности, а затем для облегчения отделения этих белков от всех других клеточных белков. Используя более совершенную химию, биотиновые метки можно использовать для специфического обогащения определенных типов белков, таких как АТФазы, ГТФазы и серингидролазы.Такие эксперименты неосуществимы с использованием только антител, особенно в качестве метода обнаружения новых белков.

Однако эти стратегии обогащения (где целью является элюирование и извлечение меченой биотином мишени из стрептавидиновой смолы) обычно требуют адаптации стандартной системы авидин-биотин. Это связано с тем, что нативное взаимодействие очень сильное и очень устойчиво к диссоциации. Жесткие, денатурирующие условия (8 М гуанидин•HCl, pH 1,5 или кипячение в SDS-буфере для загрузки образцов) необходимы для эффективной диссоциации комплексов авидин:биотин.Такие условия необратимо повреждают носитель, так что его нельзя использовать повторно, и денатурируют элюированные белки, так что они не сохраняют никакой биологической активности.

Справочник по приготовлению белка

Из этого 32-страничного руководства вы узнаете больше об обессоливании, замене буфера, концентрировании и/или удалении загрязнений из образцов белков, иммунопреципитации и других методах очистки и очистки белков с помощью различных инструментов Thermo Scientific для биологии белков.

• Иммунопреципитация (IP), Co-IP и хроматин-IP
• Метки для очистки рекомбинантных белков
• Безопасный диализ образцов белков с помощью диализных кассет и устройств Slide-A-Lyzer
• Быстрое обессоление образцов с высоким извлечением белка с помощью Zeba spin Колонки и планшеты для обессоливания
• Эффективное извлечение специфических примесей с использованием смол, оптимизированных для удаления детергентов или эндотоксинов возможна элюция
  1. Мономерная смола авидина:  В отличие от нативного тетрамерного белка субъединицы мономерного авидина менее сильно связываются с биотином, что позволяет конкурентно замещать захваченные биотинилированные мишени с использованием избытка свободного биотина.
  2. Расщепляемые реагенты для биотинилирования:  Некоторые реагенты для биотинилирования содержат дисульфидную связь в своих спейсерных плечах или конъюгированы с белком через дисульфидные связи. Биотинилированные белки могут быть элюированы из аффинной смолы путем расщепления дисульфидной связи восстановителем. Группа биотина остается связанной со смолой, а белок извлекается (без биотиновой метки). Набор для выделения белков клеточной поверхности использует эту стратегию (маркировка сульфо-NHS-SS-биотином).
  3. Дестиобиотин и производные иминобиотина:  Это модифицированные формы биотина, которые менее сильно связываются с белками авидина и стрептавидина.В зондах активного сайта и наборах для обогащения используются реагенты дестиобиотина. Доступно несколько реагентов дестиобиотинилирования для мечения белков по различным функциональным группам.

  ---

  Белковые взаимодействия

  Подобно иммунопреципитации, традиционные анализы коиммунопреципитации требуют специфических первичных антител для захвата целевого антигена. При коиммунопреципитации целевой антиген часто называют белком-приманкой, и конечной целью является использование белка-приманки для извлечения дополнительных взаимодействующих белков-жертв.Как и анализы иммунопреципитации, биотинилированные антитела для захвата могут помочь преодолеть потенциальные проблемы, связанные с процессом захвата и обогащения. Однако анализ коиммунопреципитации можно дополнительно модифицировать, чтобы не было необходимости в захватывающем антителе. Полученный в результате анализ вытягивания обычно проводят с меченым белком-приманкой. Во многих случаях меченый белок-приманка представляет собой рекомбинантный слитый белок, модифицированный одной из нескольких аффинных меток (6-кратный гистидин, гемагглютининовый антиген, глутатион-s-трансфераза и т.), но также возможно проводить эти анализы с биотинилированным белком-приманкой. Белок приманки просто необходимо модифицировать с помощью биотиновой метки перед выполнением анализа вытягивания. Несмотря на то, что требуется источник очищенного белка-приманки, анализы вытягивания, проводимые таким образом, преодолевают потенциальные проблемы, которые могут возникнуть, когда рекомбинантные модификации генерируют неактивный белок или другие нежелательные артефакты. На следующем рисунке представлен обзор рабочего процесса.

  Краткое изложение процедуры для наборов для взаимодействия с белками GST и His Tag.

  ---

  Приманка для анализа методом вытягивания не обязательно должна быть белком. Пептиды, лекарства и нуклеиновые кислоты также могут использоваться в качестве приманки для захвата взаимодействующих белков. Эти зонды также можно использовать для обнаружения взаимодействия белков без этапа захвата и обогащения. В EMSA или анализе сдвига в геле обнаруживаются белки, связывающие нуклеиновые кислоты, поскольку они вызывают изменение скорости миграции меченых зондов во время электрофореза через гелевую матрицу. Биотинилированные зонды, используемые таким образом, весьма эффективны при использовании с оптимизированной системой обнаружения.

  Еще одним передовым методом обнаружения белковых взаимодействий является метод переноса метки. В этой процедуре белок-приманка модифицируется переносимой меткой. Реагенты, разработанные для этой цели, имеют две реактивные группы, первая из которых реагирует с белком-приманкой, а вторая реактивная группа активируется после установления взаимодействия белка-приманки с добычей. Затем, когда меткой является биотин, эти реагенты для переноса метки позволяют захватывать и обогащать взаимодействующий целевой белок для идентификации на последующих этапах.

  ---

  1. Грин Н. М. (1963). авидин. 3. Природа сайта связывания биотина. Biochem J. 89: 599–609.
  2. Ливна О; Байер, EA; Вильчек, М; Сассман, Дж. Л. (1993). «Трехмерные структуры авидина и комплекса авидин-биотин». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки.   90(11):  5076–80.
  3. Argarana C.E. и др. др. , (1986). Молекулярное клонирование и нуклеотидная последовательность гена стрептавидина. НАР.   14(4): 1897–1882.
  4. Марттила, А.Т. и др. др. , (2000). Рекомбинантный NeutraLite Avidin: негликозилированный кислый мутант куриного авидина, который проявляет высокое сродство к биотину и низкие свойства неспецифического связывания. Письма ФЕБС.   467(1): 31–36.

  Биотин, митохондрии и деменция: исследования показывают связь

  Кредит: Википедия

  По любым меркам жизнь на основе углерода возникла в результате карбоксилирования.То есть соединение атмосферного углекислого газа с сахаром. Карбоксилирование также имеет решающее значение для функционирования митохондрий. В митохондриях есть пять ферментов карбоксилирования, и у них есть одна общая черта — все они управляются ковалентно связанным биотиновым кофактором.

  Биотин также известен как витамин H, названный в честь немецких слов «Haar» и «Haut», которые означают волосы и кожу.Это было связано с тем, что даже небольшой дефицит вызывает истончение волос, кожную сыпь или ломкость ногтей. Новое исследование, только что опубликованное в PNAS , теперь показывает, что некоторые формы тяжелой нейродегенерации, такие как лобно-височная деменция, наблюдаемая при болезнях Альцгеймера и Паркинсона, могут быть прямым результатом недостатка биотина.

  Авторы обнаружили это, наблюдая за плодовыми мушками, страдающими слабоумием. Прежде чем кто-нибудь усмехнется, дрозофилы на самом деле могут стать прекрасной моделью болезни Альцгеймера или других болезней, если им дать правильные гены.Человеческие версии дефектных генов MAPT (тау) вызывают у этих мух развитие таупатий, которые напоминают те, которые возникают в нашем собственном мозгу. Чтобы глубже изучить нейротоксичность тау, они изучили более 7000 генов мух в прямом генетическом скрининге, прежде чем остановились на одном значительно модифицированном токсичности мутанта tauR406W. Этот ген, Btnd, кодирует фермент биотинидазу, который извлекает биотин из пищевых источников или перерабатывает его из использованных ферментов.

  Биотин поступает к нам в форме биоцитина, который представляет собой просто биотин, связанный с лизином.Btnd отщепляет биотин от биоцитина или от его присоединения к лизину в карбоксилазах. Когда Btnd также был искалечен мухами, их слабоумие ухудшилось. Кроме того, их митохондрии также деформировались и удлинялись. Исследователи смогли устранить все эти эффекты, просто дав дополнительный биотин, предполагая, что некоторые люди с деменцией могут получить аналогичную пользу. Им также удалось собрать воедино механизм, который функционально связывает тау и Btnd.

  Хотя своенравные варианты тау часто наносят ущерб цитоплазме нейронов, слипаясь в гиперфосфорилированные клубки, другие изоформы тау локализованы внутри ядра, где они могут нарушать организацию гетерохроматина.Гетерохроматин состоит в основном из плотно свернутых сегментов хромосом, где неиспользуемые гены плотно уложены вместе. Нарушение этих упорядоченных структур, вероятно, приведет к аберрантной экспрессии многих генов. В рассматриваемом случае ген Brnd в р-диапазоне в районе 25 хромосомы 3, по-видимому, имеет один особенно уязвимый локус.

  К сожалению, это все, что авторы смогли доказать, что именно так все и происходит. Однако, как мы сообщали вчера, теперь есть потенциальные способы воочию убедиться, не приставал ли регион Брдн к бродячим тау. Путем нацеливания на этот локус с помощью нового всепространственного секвенирования in situ ген может быть не только локализован в ядре, но и с помощью вычислений может быть реконструировано свернутое состояние всей хромосомы на основе данных. Хотя такие поразительные возможности, несомненно, были бы полезны, на данный момент более важный вопрос заключается в том, кому именно может быть полезна биотиновая терапия?

  Во вторник мы обсуждали неправильное поведение митохондрий в контексте рака и отметили, что так называемые редкие варианты на самом деле не так уж редки.Люди редко знают, какие варианты у них есть, когда они все еще бессимптомны и относительно здоровы. Биотинидаза Brnd является отличным примером. Уже известно около 100 мутаций, так или иначе влияющих на функцию гена. Теперь они постоянно отслеживаются в специальной базе данных вариантов, в которой регистрируются вставки, дупликации, делеции Brnd, аномалии сплайсинга или смысловые, бессмысленные и миссенс-изменения.

  Некоторые из этих мутаций вызывают нефункционирующий фермент или полностью останавливают его производство, в то время как другие, по-видимому, малоэффективны.Википедия говорит нам, что «поскольку это состояние наследуется по аутосомно-рецессивному типу, две копии гена в каждой клетке должны быть изменены, чтобы у человека было заболевание». Википедия нас обманывает. Любой врач, который говорит что-то подобное, лжет нам. На самом деле, распространяя этот миф о незараженном носителе, наука лжет сама себе.

  Правда в том, что если у вас есть только один сомнительный вариант, вы затронуты на каком-то уровне, осознаете вы это или нет.Например, если в возрасте 23 лет ваш Хаар быстро похудел, а линия роста волос уменьшилась, скажем, на 50%, как вы можете быть уверены, что вас это не коснулось? Вы можете измерить активность фермента биотинидазы в крови или клетках кожи и обнаружить, что она выше 50%, но действительно ли этот уровень достаточно хорош для вас? Тот вылет в конце девятого еще в шестом классе — могла ли быть другая судьба, если бы не немного биотина?

  Как упоминалось выше, существует пять важнейших митохондриальных карбоксилаз, активируемых биотином. Их стоит перечислить:

  • АцетилКоА-карбоксилазы 1 и 2 (или А и В), используемые в синтезе и окислении жирных кислот, соответственно
  • Пируваткарбоксилаза, используемая в глюконеогенезе в катаболизме лейцина

  Чтобы узнать, насколько на вас влияют варианты биотинидазы, вам также необходимо знать об активности любых вариантов, которые могут быть у вас в любом из этих ферментов, использующих биотин.В принципе, любые дальнейшие нисходящие варианты в пределах этих путей, возможно, также должны быть включены в быстро расходящееся уравнение. Ацетил-КоА-карбоксилазы имеют другое измерение, интересное для нас. Митохондриальная изоформа ACC1 необходима для синтеза липоевой кислоты, которая является еще одним любопытным кофактором, имеющим много общего с биотином.

  Например, структурно сходные серосодержащие биотин и липоевая кислота являются единственными кофакторами, которые ковалентно связаны с исходным ферментом — в обоих случаях на лизине.В наших клетках созданы особые условия для синтеза липоевой кислоты. Недавно было обнаружено, что митохондрии поддерживают бактериальный синтез жирных кислот, чтобы генерировать октановую кислоту, предшествующую липоевой кислоте.

  На данный момент вопрос о том, кому из нас может быть полезен прием биотина и в какой дозе, остается открытым. Мы знаем, что если у вас есть дефицит или вы подозреваете его, то следует избегать сырых яичных белков, которые содержат высокие уровни чистого авидина, потому что они жадно связываются с биотином.

  ---

  FDA: биотиновые добавки могут повлиять на результаты медицинских тестов

  ---

  Дополнительная информация: Келли М. Лор и др. Биотин лечит митохондриальную дисфункцию и нейротоксичность в модели таупатии, Proceedings of the National Academy of Sciences (2020).DOI: 10.1073/pnas.1922392117

  © 2021 Наука Х Сеть

  Цитата : Биотин, митохондрии и деменция: исследования показывают связь (2021, 7 января) получено 20 марта 2022 г. с https://medicalxpress.com.com/news/2021-01-biotin-mitochondria-dementia-reveals.html

  Этот документ защищен авторским правом. Помимо любой добросовестной сделки с целью частного изучения или исследования, никакие часть может быть воспроизведена без письменного разрешения. Контент предоставляется только в ознакомительных целях.

  Мощный инструмент для очистки белковых комплексов и протеомного картирования

  В клетках бактерий, дрожжей и млекопитающих содержится примерно 2–4 миллиона белков на кубический микрон (Milo, 2013).Количество взаимодействий между этими белками трудно вообразить еще в одних исследованиях.

  Для выяснения этих взаимодействий ученые уже давно используют аффинную очистку на основе антител и подходы масс-спектрометрии. Однако недавно ученые разработали новые методы, называемые маркировкой на основе близости, чтобы лучше фиксировать эти взаимодействия в широком спектре биологических контекстов.

  Близкое мечение основано на мечении соседних белков в клетке биотином.Биотин является природным коферментом, который прочно связывает гликопротеин, авидин или аналогичный белок, стрептавидин. Это сильное взаимодействие позволяет ученым легко очищать и идентифицировать любые белки, помеченные биотином, используя методы очистки, покрытые авидином. Из-за высокой аффинности биотина к авидину близлежащее мечение может фиксировать слабые/временные белковые взаимодействия, а также использоваться как для растворимых, так и для нерастворимых белков, что может быть проблемой для классических методов аффинной очистки/масс-спектрометрии на основе антител.

  BioID: неразборчивая биотинлигаза, которая может эффективно метить соседние белки

  В 2012 г. в лаборатории Брайана Берка была разработана первая методика маркировки на основе биотина, BioID (Roux et al. , 2012). В BioID используется биотинлигаза E. coli , BirA*, с мутацией сайта (R11G). Эта мутация сайта дестабилизирует лигазу, позволяя активным молекулам биотина диссоциировать от лигазы и связываться с открытыми лизинами на соседних белках. Таким образом, для захвата белковых комплексов ученые могут просто экспрессировать в клетках белок-приманку, слитый с BirA*, а затем инкубировать эти клетки с экзогенным биотином.Через несколько часов биотинилированные белки могут быть захвачены стрептавидиновыми аффинными гранулами или матрицами. Белок-приманка может даже нацеливать BirA* на определенные субклеточные участки, такие как ядерная оболочка, что позволяет ученым исследовать взаимодействия в интересующих местах.

  Попробуйте BioID в своем эксперименте по маркировке сближения!

  APEX: сконструированная аскорбатпероксидаза, которая может быстро метить биотином белки

  Через год после того, как BioID стал доступен, лаборатория Элис Тинг продемонстрировала, что сконструированная аскорбатпероксидаза (APEX), используемая в качестве генетической метки для электронной микроскопии, может быть использована для эффективной маркировки сближения (Rhee et al. , 2013). APEX катализирует окисление биотин-фенола до короткоживущего биотин-феноксильного радикала в присутствии перекиси водорода. Этот радикал реагирует с богатыми электронами аминокислотами, такими как тирозин, на соседних белках, что приводит к их биотинилированию. Преимуществом APEX является его скорость: маркировка соседних белков занимает минуты, а не часы, как у BioID. APEX позволил ученым идентифицировать протеомную карту митохондриального матрикса человека (Rhee et al., 2013) и определить топологию митохондриального унипортера кальция (Martell et al., 2012). Важно отметить, что реагент биотин-фенол может быть токсичным для живых клеток, поэтому APEX не подходит для исследований органоидов или in vivo (Che and Khavari, 2017).

  Найдите плазмиды APEX в Addgene!

  С момента разработки BioID и APEX были разработаны оптимизированные версии BioID и APEX, а также новые методы бесконтактной маркировки. Эти новые инструменты в настоящее время также доступны в Addgene.

  BioID2: улучшенная беспорядочная биотинлигаза меньшего размера

  Лаборатория Ру в 2016 году оптимизировала BioID для создания BioID2, меньшей и улучшенной беспорядочной биотинлигазы (Kim et al 2016).BioID2 состоит из гуманизированной биотинлигазы из A. aeolicus , в которой отсутствует ДНК-связывающий домен (233 аминокислоты), обнаруженный в версии E. coli . Он также содержит единственную мутацию (R40G) в консервативном остатке в каталитическом домене биотина, обеспечивающую неразборчивое биотинилирование. По сравнению с BioID, BioID2 демонстрирует улучшенное проксимальное мечение, требует меньше биотина и позволяет ученым более избирательно нацеливать слитые белки на определенные места в клетке.

  Найдите здесь плазмиды BioID2

  APEX2: более чувствительная аскорбатпероксидаза для бесконтактного мечения

  Основным ограничением APEX была его низкая чувствительность.Чувствительность может быть повышена при более высоких уровнях экспрессии, но для многих слитых белков это приведет к агрегации белков/органелл. Лаборатория Тинга предположила, что низкая чувствительность была связана с неоптимальной складкой или стабильностью. Таким образом, они провели несколько раундов направленной эволюции, пока не идентифицировали мутанта со значительно повышенной чувствительностью, которая не влияла на функцию или эффективность исходного APEX (Lam et al. 2014). Они назвали этот мутант APEX2.

  Найдите плазмиды APEX2!

  TurboID и minturbo: быстрая и нетоксичная бесконтактная маркировка 

  TurboID и miniTurbo были разработаны в Ting Lab в 2018 году для увеличения скорости бесконтактной маркировки биотинлигазами (Branon et al., 2018). Для маркировки белков BioID и BioID2 могут потребоваться часы, а APEX2, хотя он может быстро маркировать белки, требует h3O2, который может быть токсичным для живых клеток. Чтобы обойти эти проблемы, лаборатория Ting использовала направленную эволюцию на основе дрожжевого дисплея для создания двух мутантов: 35 кДа TurboID, который имеет 15 мутаций по сравнению с BirA, и 28 кДа miniTurbo, у которого удален N-концевой домен и 13 мутаций по сравнению с BirA. BirA дикого типа. И TurboID, и miniTurbo позволяют маркировать биотином за 10 минут без каких-либо проблем с токсичностью.Сигнал TurboID значительно выше, чем у miniTurbo в более ранние моменты времени, но miniTurbo демонстрирует меньшее мечение до добавления экзогенного биотина, что позволяет более точно контролировать время.

  Найти плазмиды для TurboID и miniturbo

  Split-BioID: условный протеомный подход к мониторингу белок-белковых взаимодействий

  Split-BioID сочетает в себе метод комплементации белковых фрагментов (PCA) с близостью метки для проверки бинарного белок-белкового взаимодействия, а также для идентификации дополнительных взаимодействующих белков в одном простом эксперименте.PCA — это метод in vivo , в котором два белка сливаются с комплементарными репортерными белками, которые могут собираться только в непосредственной близости. Split-BioID состоит из расщепленной молекулы BirA*, которая может повторно собираться для восстановления активности при слиянии с двумя взаимодействующими белками (Schopp et al. , 2016). Таким образом, в одном эксперименте ученый может подтвердить и проконтролировать взаимодействие двух белков, а также пометить биотином и очистить дополнительные белки от интересующего комплекса.

  Для получения дополнительной информации прочитайте сообщение в блоге Split-BioID.

  RaPID: обнаружение взаимодействия РНК-белок

  До сих пор мы рассматривали способы изучения белок-белковых взаимодействий, но ученые также разработали способы обнаружения РНК-белковых взаимодействий, которые могут регулировать множество биологических функций. RapID (обнаружение взаимодействия РНК-белок) использует маркировку близких белков на основе BioID для идентификации взаимодействий РНК-белок (Ramanathan et al., 2018). Для разработки RapID ученые создали мутант BirA* из B. subtilis , получивший название BASU.BASU демонстрирует в 1000 раз более быструю кинетику и увеличивает отношение сигнал/шум в 30 раз по сравнению со стандартным мутантом E. coli BirA*. RapID состоит из этого мутанта BirA* и компонента РНК, который содержит интересующий мотив РНК. Любые белки, которые связывают мотив РНК, будут биотинилированы.

  Узнайте больше о RapID!

  EXCELL: Метка близости для обнаружения межклеточных взаимодействий

  EXCELL представляет собой ферментативно-опосредованную стратегию мечения клеток для обнаружения межклеточных взаимодействий in vivo (Ge et al., 2019). Этот метод основан на варианте транспептидазы-сортазы A S. auerus (mgSrtA), который способен беспорядочно маркировать различные белки клеточной поверхности, содержащие остаток моноглицина на N-конце, небольшим пептидом (LPETG). В EXCELL вариант mgSrtA может отображаться на поверхности интересующей клетки, где он может метить взаимодействующие белки клеточной поверхности с пептидом LPETG, меченным биотином. Затем меченные биотином белки можно очистить с помощью стрептавидина и разделить с помощью проточной цитометрии.

  Найдите здесь плазмиды для EXCELL!

  С тех пор, как в 2012 году была разработана система BioID, маркировка по принципу близости стала мощным методом изучения белок-белковых взаимодействий, РНК-белковых взаимодействий, а в последнее время и межклеточных взаимодействий. Если вы хотите определить взаимодействие с вашим любимым белком или мотивом РНК, попробуйте эти методы.

  ---

  Каталожные номера:

  Брэнон, Тесс С. и др. «Эффективная маркировка в живых клетках и организмах с помощью TurboID. Nature biotechnology 36.9 (2018): 880. PubMed PMID: 30125270. PubMed Central PMCID: PMC6126969.

  Че, Юнглу и Пол А. Хавари. «Упрощенные методы исследования: новые методы выяснения белковых взаимодействий посредством пространственной близости». Journal of Investigative Dermatology  137.12 (2017 г.): e197–e203. PubMed PMID: 29169465. 

  Ge, Юн и др. «Ферментопосредованная маркировка межклеточной близости для обнаружения межклеточных взаимодействий». Журнал Американского химического общества  141.5 (2019): 1833-1837. PubMed PMID: 30676735.

  Ким, Д. И., Дженсен, С. К., Ноубл, К. А., К. С., Б., Ру, К. Х., Мотамедчабоки, К., и Ру, К. Дж. (2016). Усовершенствованная биотинлигаза меньшего размера для бесконтактной маркировки BioID. Молекулярная биология клетки , 27 (8), 1188-1196. PubMed PMID: 26912792. PubMed Central PMCID: PMC4831873.

  Лам, Стефани С. и др. «Направленная эволюция APEX2 для электронной микроскопии и бесконтактной маркировки». Природные методы  12.1 (2015): 51. PubMed PMID: 25419960. PubMed Central PMCID: PMC4296904.

  Мартелл, Джеффри Д. и др. «Разработана аскорбатпероксидаза как генетически закодированный репортер для электронной микроскопии». Nature biotechnology 30.11 (2012): 1143. PubMed PMID: 23086203. PubMed Central PMCID: PMC3699407.

  Майло, Рон. «Каково общее количество белковых молекул в объеме клетки? Призыв переосмыслить некоторые опубликованные значения». Bioessays 35.12 (2013): 1050-1055. PubMed PMID: 24114984.Центральный PMCID в PubMed: PMC3910158.

  Раманатан, Мутукумар и др. «Обнаружение взаимодействия РНК-белок в живых клетках». Природные методы  15.3 (2018): 207. PubMed PMID: 29400715. PubMed Central PMCID: PMC5886736.

  Ру, Кайл Дж. и др. «Неразборчивый слитый белок биотинлигазы идентифицирует проксимальные и взаимодействующие белки в клетках млекопитающих». J Cell Biol 196.6 (2012): 801-810. PubMed PMID: 22412018. PubMed Central PMCID: PMC3308701.

  Ри, ​​Хён-Ву и др.«Протеомное картирование митохондрий в живых клетках с помощью пространственно ограниченной ферментативной маркировки». Наука 339.6125 (2013): 1328-1331. PubMed PMID: 23371551. PubMed Central PMCID: PMC3916822.

  Шопп, Изабель Мириам и др. «Split-BioID — условный протеомный подход к мониторингу состава пространственно-временно определенных белковых комплексов». Nature Communications  8 (2017): 15690. PubMed PMID: 28585547. PubMed Central PMCID: PMC5467174.

  Дополнительные ресурсы в блоге Addgene

  Другие ресурсы
  

  О нас — Jackson ImmunoResearch

  Здравствуйте! Похоже, ваш браузер не может запускать JavaScript. Обратите внимание, что на этой странице есть функции, для правильной работы которых требуется JavaScript, поэтому эта страница может отображаться или работать не так, как предполагалось. Если возможно, рассмотрите возможность переключения на другой веб-браузер или, если вы вручную отключили JavaScript, снова включите его, чтобы содержимое этой страницы отображалось должным образом.

  Кто мы

  Компания Jackson ImmunoResearch специализируется на производстве вторичных антител для медико-биологических исследований. Наша репутация надежного поставщика основана на 40-летнем опыте очистки, конъюгации и лиофилизации иммуноглобулинов.Мы продолжаем оптимизировать процессы и разрабатывать новые технологии для удовлетворения потребностей будущих достижений в биологических методах и практиках.

  Все наши антитела производятся в наших лабораториях, расположенных в часе езды к западу от Филадельфии, штат Пенсильвания. Мы не перемаркируем (OEM) антитела других поставщиков. В дополнение к вторичным антителам мы также производим дополнительные продукты, такие как блокирующие сыворотки, контрольные белки и конъюгаты стрептавидина.

  С 2004 года компания Jackson ImmunoResearch Europe Ltd (JIR-E) является распределительным центром для европейских ученых.Расположенный недалеко от Кембриджа, Великобритания, мы обеспечиваем быструю и эффективную доставку по всей Европе, в некоторых частях Ближнего Востока и Северной Африки. JIR-E хранит запасы самых популярных продуктов, поэтому мы можем удовлетворить большинство заказов с доставкой на следующий день.

  Массовая/таможенная служба

  По запросу мы можем производить и поставлять большинство стандартных иммунореагентов оптом.

  Сочетание нашего опыта, нашего внимания к вторичным антителам и нашей приверженности самым высоким стандартам качества гарантирует, что клиенты могут быть полностью уверены в качестве продукта, согласованности и минимальном отклонении от партии к партии. Эти факторы способствуют эффективности оценки образцов и утверждению сыпучих материалов, а также достижению нашей цели по обеспечению высочайшего качества обслуживания.

  Наш опыт

  • Более 40 лет опыта работы в одной узкоспециализированной области; производство, конъюгация и поставка вторичных антител.
  • Долгосрочные отношения с клиентами в качестве признанного и надежного поставщика.
  • Быстрое и эффективное обслуживание клиентов.
  • Поддержание самых высоких стандартов в наших исследованиях, производстве и всех операциях, что способствует обеспечению гарантированного качества продукции, долгосрочной стабильности продукта и надежной работе.
  Топ

  определение биотина по The Free Dictionary

  Он содержит коллаген, кератин, биотин, крапиву, розмарин, пантотеновую кислоту и витамины. M2 PRESSWIRE-20 августа 2019 г.-: Рынок биотина станет свидетелем прибыльного спроса благодаря растущему внедрению продуктов на основе ингредиентов в пищевых и пищевых добавках до 2022 года | Million InsightsNORDIC HAIR VOLUME GUMMIES ЭТИ добавки со вкусом яблока содержат дозу биотина, цинка, хвоща и проса — всех питательных веществ, которыми питаются кожа головы и волосяные фолликулы. PS 5,69 за 30 таблеток от LloydsPharmacy New Nordic Hair Volume Gummies Эти добавки со вкусом яблока содержат дозу биотина, цинка, хвоща и проса — всех питательных веществ, которые помогают коже головы и волосяным фолликулам. Причина лабораторных анализов, похожих на гипертиреоз у этой пациентки, которая выглядит клинически эутиреоидной, заключается в том, что она принимает биотин. Биотин (витамин [B.sub.7]) в последние несколько лет стал очень популярной добавкой для лечения тонких волос, ломкости ногтей и усталости. болезни аминокислот, органических и жировых (масс-спектрометрия), глактоземия, Другие исследования включают кардиологическое исследование для выявления критических врожденных деформаций сердца и ранний скрининг нарушений слуха у новорожденных для выявления наследственной глухоты.Ломкие ногти и волосы могут быть признаком дефицита витамина B7 (биотина).* Ночная ваниль: сливочный напиток, приготовленный из настоящей таитянской ванили, обогащенный коллагеном, биотином, гиалуроновой кислотой и кокосовым маслом для повышения увлажненности и эластичности кожи. Сорок три пациента (средний возраст 61 год) с прогрессирующим рассеянным склерозом (медиана продолжительности заболевания 23 года; 26 вторично-прогрессирующих, 7 первично-прогрессирующих, 10 рецидивирующе-ремиттирующих с прогрессированием) получали 300 мг биотина один раз в день в течение минимум один год.Каждый продукт, созданный с использованием уникального комплекса SciNatranol, наполнен полезными свойствами бамбука, базилика и биотина, которые обладают увлажняющими, укрепляющими, антисептическими и антибактериальными свойствами, способствующими здоровью и росту кожи головы и волос. Доза D-биотин представляет собой природную форму биотина, которая поддерживает многочисленные функции организма.

  витаминов Spring Valley, сделанных в Китае? Требуется дополнительная информация

  Витаминные и минеральные добавки не продлят вам жизнь, говорится в исследовании

  Исследователи из Университета Тафтса не обнаружили связи между витаминными и минеральными добавками и более низким риском смерти.

  USA TODAY

  Утверждение: витамины Spring Valley от Walmart производятся в Китае, а витамины Sundown производятся в США

  Сообщение на Facebook утверждает, что витамины Spring Valley, эксклюзивный бренд Walmart, производятся в Китае, и витамины небезопасны для употребления.

  «Если вы покупаете витамины SpringValley в Wal-Mart, остановитесь!» — говорится в сообщении Facebook от 27 апреля. «Витамины SpringValley производятся в Китае. Витамины Sundown производятся в США…»

  Аналогичные заявления появились в 2018 году после того, как пользователь разместил видео на YouTube в продуктовом магазине, в котором утверждалось, что витамины Spring Valley из Китая.На видео показана этикетка бутылки витаминов Spring Valley с надписью «Product of China».

  Spring Valley — известный бренд витаминов в Соединенных Штатах, который продается через Интернет и лично в магазинах Walmart, а также на Amazon. В последние годы бренд вызвал споры по поводу маркировки своей продукции.

  Подробнее: Продажи Walmart выросли на 10%, так как онлайн-покупки выросли на 74% во время пандемии коронавируса товары не являются небезопасными из-за коронавируса.

  «В настоящее время нет доказательств, подтверждающих передачу COVID-19, связанную с импортными товарами, включая продукты питания и лекарства для людей и домашних животных», — говорится на сайте. «В США не было случаев заражения COVID-19, связанных с импортными товарами».

  Натан Арнольд, представитель Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, сказал, что витамины регулируются и рассматриваются как «пищевые добавки», и отметил, что все пищевые добавки должны соответствовать правилам для обеспечения безопасности, качества и точной маркировки.

  Walmart не ответил USA TODAY на запрос о комментариях.

  Подробнее: Walmart обновляет приложения из-за коронавируса, чтобы объединить продукты с электроникой, игрушками и многим другим

  Доступная информация варьируется на этикетках не указан.

  

  ConsumerLab.com заявляет, что в пищевых добавках, продаваемых в США, не требуется указывать страну происхождения ингредиентов.

  «Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов требует, чтобы на этикетках был указан номер телефона или адрес для связи с производителем или дистрибьютором, но это не обязательно место производства продукта», — говорится на сайте. «Если продукт произведен за пределами США, название этой страны должно быть указано на этикетке».

  Пользователи в комментариях к посту отметили, что утверждение не соответствует действительности, и разместили фотографии своих витаминов Spring Valley, где указано «продукт Дании», в то время как другие пользователи отметили, что на их бутылке не указана страна происхождения.

  В сообщении Reference.com говорится, что продукты Walmart, в которых не указана страна происхождения, производятся в Соединенных Штатах.

  «Эта линейка витаминов не производится и не разливается ни в Китае, ни на Тайване; однако некоторые витаминные продукты Spring Valley действительно содержат сырье, полученное из этого региона», — говорится на сайте.

  На фотографиях нескольких продуктов Spring Valley на Amazon.com видны этикетки с надписью «Продукт из Китая» или «Продукт из Китая и США», но неясно, насколько актуальны эти изображения.

  Наш рейтинг: Требуется дополнительная информация

  Нет доказательств того, что витамины Spring Valley происходят из Китая. Ни один производитель или страна происхождения не могут быть обнаружены в базе данных этикеток пищевых добавок. Дистрибьютор продуктов Walmart не прокомментировал это заявление. Без этой информации мы не можем сказать, является ли утверждение истинным, ложным или где-то посередине.

  Наши источники для проверки фактов:

  Спасибо за поддержку нашей журналистики.Вы можете подписаться на наше печатное издание, приложение без рекламы или копию электронной газеты здесь.

  Наша работа по проверке фактов частично поддерживается грантом от Facebook.

  Основные принципы и типы ИФА

  Рисунок 1. Базовая установка анализа ELISA. Захватывающее антитело на многолуночном планшете иммобилизует интересующий антиген. Этот антиген будет распознаваться и связываться детектирующим антителом, конъюгированным с биотином и стрептавидином-HRP.

  Анализ ELISA обычно проводят в многолуночном планшете (96- или 384-луночном), который обеспечивает твердую поверхность для иммобилизации антигена. Иммобилизация аналитов облегчает отделение антигена от остальных компонентов в образце. Эта характеристика делает ИФА одним из самых простых анализов для одновременного выполнения нескольких образцов.

  Для получения дополнительной информации просмотрите наш вебинар о принципах ELISA.

  
  Преимущества и недостатки ИФА

  Преимущества

  • Высокая чувствительность и специфичность: благодаря использованию антител, ИФА очень специфично определяет антигены на уровне пикограмм.
  • Высокая производительность: коммерческие наборы ELISA обычно доступны в формате 96-луночных планшетов. Но анализ можно легко адаптировать к 384-луночным планшетам.
  • Простота выполнения: протоколы просты в использовании и требуют минимум времени.
  • Количественный: позволяет определить концентрацию антигена в образце.
  • Возможность тестирования различных типов образцов: сыворотки, плазмы, клеточных и тканевых экстрактов, мочи и слюны среди прочих.

  Недостатки

  • Временные показания: обнаружение основано на реакциях фермент/субстрат, поэтому показания должны быть получены за короткий промежуток времени.
  • Ограниченная информация об антигене: информация ограничена количеством или присутствием антигена в образце.
  
  

  Выбор правильного типа ELISA

  Существует четыре основных типа ELISA: прямой ELISA, непрямой ELISA, сэндвич-ELISA и конкурентный ELISA. Каждый из них имеет уникальные преимущества, недостатки и пригодность.

  Рисунок 2. Различные типы ИФА (прямой, непрямой, сэндвич и конкурентный)

  Прямой ИФА

  антитело, специфичное к антигену. Антитело непосредственно конъюгировано с HRP или другими молекулами для обнаружения.

  Непрямой ИФА 

  Непрямой ИФА – это метод, в котором используется двухэтапный процесс обнаружения, при котором первичное антитело, специфичное к антигену, связывается с мишенью, а меченое вторичное антитело против видов-хозяев первичного антитела связывается с мишенью. первичное антитело для обнаружения. Что касается прямого анализа ELISA, антиген иммобилизуют на поверхности многолуночного планшета.

  Этот метод также можно использовать для обнаружения специфических антител в образце сыворотки путем замены первичного антитела сывороткой.

  Обзор наборов и реагентов для непрямого ИФА

  Сэндвич-ИФА

  Сэндвич-ИФА (или сэндвич-иммуноанализ) является наиболее часто используемым форматом. Этот формат требует наличия двух антител, специфичных к разным эпитопам антигена. Эти два антитела обычно называют согласованными парами антител. Одно из антител наносится на поверхность многолуночного планшета и используется в качестве захватывающего антитела для облегчения иммобилизации антигена. Другое антитело конъюгировано и облегчает обнаружение антигена.

  Explore Наборы и реагенты для сэндвич-ИФА

  Конкурентный ИФА

  Также известный как ИФА с ингибированием или конкурентный иммуноанализ, конкурентный ИФА измеряет концентрацию антигена путем обнаружения интерференции сигнала. Каждый из предыдущих форматов может быть адаптирован к соревновательному формату.

  Антиген образца конкурирует с эталонным антигеном за связывание с определенным количеством меченого антитела. Эталонный антиген предварительно нанесен на многолуночный планшет, а образец предварительно инкубирован с меченым антителом и добавлен в лунки.В зависимости от количества антигена в образце будет доступно большее или меньшее количество свободных антител для связывания эталонного антигена. Это означает, что чем больше антигена в образце, тем меньше эталонного антигена будет обнаружено и тем слабее будет сигнал.

  Некоторые конкурирующие наборы ELISA используют меченый антиген вместо меченого антитела. Меченый антиген и антиген образца (немеченый) конкурируют за связывание с первичным антителом. Чем меньше количество антигена в образце, тем сильнее сигнал из-за большего количества меченого антигена в лунке.

  Ознакомьтесь с наборами и реагентами для ИФА других производителей

  Какой тип ИФА мне следует использовать?

  	Преимущества	Недостатки
  Прямой ИФА	Экономия времени и реагентов: Нет перекрестной реактивности от вторичного антитела.	Потенциально высокий фон: все белки в образце связываются с поверхностью. Нет усиления сигнала. Низкая гибкость: первичное антитело должно быть конъюгировано.
  Непрямой ИФА	Усиление сигнала: несколько вторичных антител будут связываться с первичным антителом. Высокая гибкость: одно и то же вторичное антитело можно использовать для нескольких первичных антител.	Длинный протокол по сравнению с прямым ИФА. Возможна перекрестная реактивность вторичного антитела.
  Сэндвич-ИФА	Высокая специфичность: два антитела обнаруживают разные эпитопы на одном и том же антигене. Подходит для сложных образцов. Высокая гибкость и чувствительность: можно использовать как прямые, так и непрямые методы.	Требовательный дизайн: поиск двух антител против одной и той же мишени, которые распознают разные эпитопы и хорошо работают вместе, иногда может быть сложной задачей.
  Конкурентный ИФА	Зависит от выбранного базового ИФА. Подходит для небольших антигенов. Добавить комментарий Отменить ответ Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены * Комментарий * Имя * Email * Сайт