Bcaa комплекс аминокислот: Комплекс аминокислот BCAA Грейпфрут 300 г VPLAB

BCAA можно употреблять до, во время и после тренировки. Напитки из сывороточного протеина содержат полный спектр всех трех специальных аминокислот. Для достижения оптимальных результатов используйте их в сочетании со здоровой и сбалансированной диетой. Если вы хотите повысить уровень лейцина, убедитесь, что коричневый рис и цельнозерновые продукты являются частью вашего обычного рациона. Орехи, такие как миндаль и кешью, богаты изолейцином, а валин выбирают молочные продукты, зерна, грибы и арахис. Продукты животного происхождения, такие как красное мясо, рыба, яйца и курица, а также вегетарианские альтернативы, такие как соя, также полны BCAA.

BCAA (аминокислоты) — Getty Equine Nutrition, LLC

Аминокислоты с разветвленной цепью (B.C.A.A.) — Дополнение для максимального наращивания мышечной массы

г. до н. Э. Complex ™ обеспечивает более 10 000 мг аминокислот вместе с поддерживающими питательными веществами для максимальной добавки для наращивания мышечной массы .B.C.A.A. Complex ™ содержит аминокислоты с разветвленной цепью, которые являются предпочтительными аминокислотами, используемыми для выработки мышечной энергии, и, согласно исследованиям, играют важную роль в управлении усталостью во время упражнений.

Кроме того, предоставление дополнительных B. C.A.A. может помочь сохранить мышечную массу во время напряженных упражнений:

• Уменьшает накопление молочной кислоты
• Поддерживает более высокую скорость
• Улучшает восстановление после потери мышечной массы после нагрузки или состояний, которые приводят к потере мышечной массы
• Уменьшает разрушение мышц

Ингредиенты (на порцию 10 грамм)

• L-валин 3800 мг
• L-лейцин 4500 мг
• L-изолейцин 1600 мг
• Пиридоксин (витамин B6) 500 мг
• L-глутамат 350 мг
• Сульфат магния 101 мг
• Цинк (хелат аминокислоты) 17 мг
• Пиколинат хрома 24 мкг

НАПРАВЛЕНИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ: (ПОРОШОК):

• Ежедневное использование: Давайте 1 мерную ложку (около 12 граммов) два раза в день или по указанию ветеринара или специалиста по питанию лошадей.

• Использование перед мероприятием: Принимайте 2 мерные ложки (примерно 24 грамма) 2 раза в день в течение 3 дней до и в день события.

• Примечание: Используйте в соответствии с правилами событий, которые регулируют использование всех продуктов, включая время, когда продукты могут быть использованы.

Размер порции: • Закрытая мерная ложка вмещает 12 граммов.

НАПРАВЛЕНИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ: (ПАСТА):

• Обучение: Вводите 1/2 тюбика (прибл. 40 куб. См) два раза в день.

• Упражнение на выносливость: Вводите 1/3 пробирки (примерно 26 куб. См) каждые 2–3 часа активности.

• Альтернативное дозирование: Введите 1 пробирку (примерно 80 куб. См) за 3-4 часа до события.

• Примечание: Используйте в соответствии с правилами событий, которые регулируют использование всех продуктов, включая время, когда продукты могут быть использованы.

Размер порции: • 1/2 тюбика — прибл. 40cc

Заявление об отказе от ответственности: За исключением случаев, предусмотренных настоящим документом, никакие гарантии не являются явными или подразумеваемыми.Ни Peak Performance Nutrients, Inc., ни ее авторизованные реселлеры не несут ответственности за любой косвенный, случайный, особый или косвенный ущерб, возникший в результате использования этого продукта.

Информация о размерах, цене и обслуживании

Все размеры с Бесплатная доставка в континентальной части США . (через UPS) * см. ниже

• 1,5 фунта — Обеспечивает 56 порций 95,95 $
• 4 фунта — Обеспечивает 151 порцию 218,95 долл. США
• 25 фунтов — Обеспечивает 945 порций 1099 долларов.05
• ДВЕ пробирки для пасты по 80 см3 — 4 дозы $ 34,95

Информация для доставки

* BCAA Complex отправляется через UPS в течение 1-2 дней после вашего заказа. Бесплатная доставка в пределах континентальной части США. Доставка на Аляску, Гавайи, Канаду и все международные регионы оплачивается отдельно. Пожалуйста, напишите по адресу [email protected] или позвоните по телефону 940-272-0001 , чтобы узнать точную стоимость доставки до оформления заказа для этих регионов.

Заинтересованы в Auto-Ship?

Отправьте Getty Equine Nutrition электронное письмо на адрес GettyEquineNutrition @ gmail.com или позвоните по телефону 940-272-0001.

Аминокислоты с разветвленной цепью усиливают преждевременное старение благодаря усилению экспрессии белка p21, опосредованной комплексом I рапамицина у млекопитающих

Abstract

Аминокислоты с разветвленной цепью (BCAA) применялись в качестве пероральных добавок для пациентов с циррозом печени. BCAA не только улучшают пищевой статус пациентов, но и снижают заболеваемость раком печени. Мишень рапамицина у млекопитающих (mTOR) связывает клеточный метаболизм с ростом и пролиферацией в ответ на питательные вещества, энергию и факторы роста. Было показано, что BCAA, особенно лейцин, регулируют синтез белка посредством активности mTOR. С другой стороны, предполагается, что клеточное старение действует как механизмы подавления опухоли и индуцируется множеством стимулов, включая препараты, вызывающие повреждение ДНК. Однако неясно, как добавки BCAA предотвращают заболеваемость раком печени у пациентов с циррозом. Здесь мы показали, что раковые клетки человека, HepG2 и U2OS, культивируемые в среде, содержащей BCAA с соотношением Фишера около 3, которые, как было показано, обладают самой высокой активностью по синтезу и секреции альбумина, обладают более высокой активностью по индукции преждевременного старения и повышению активности mTORC1.Кроме того, сами BCAA усиливали преждевременное старение, вызванное лекарствами, вызывающими повреждение ДНК, которое эффективно предотвращалось рапамицином. Эти результаты убедительно подтверждают вклад пути mTORC1 в регуляцию преждевременного старения. Интересно, что уровни белка p21, мишени p53 и хорошо известного гена, необходимого для выполнения клеточного старения, повышались в присутствии BCAA. Эти результаты предполагают, что BCAA, возможно, способствуют подавлению опухоли за счет усиления клеточного старения, опосредованного сигнальным путем mTOR.

Образец цитирования: Nakano M, Nakashima A, Nagano T, Ishikawa S, Kikkawa U, Kamada S (2013) Аминокислоты с разветвленной цепью усиливают преждевременное старение за счет усиления экспрессии белка p21, опосредованной комплексом I рапамицина у млекопитающих. PLoS ONE 8 (11): e80411. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0080411

Редактор: Гокул М. Дас, Институт рака Розуэлл-Парк, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 20 февраля 2013 г .; Дата принятия: 2 октября 2013 г .; Опубликовано: 6 ноября 2013 г.

Авторские права: © 2013 Nakano et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа частично поддержана грантом на научные исследования в приоритетных областях Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии, а также грантом на научные исследования. (B) Японского общества содействия науке.Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Синтаро Исикава был сотрудником Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Это не влияет на соблюдение авторами всех политик PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами, как подробно описано в руководстве для авторов.

Введение

Уровень аминокислот в периферической крови пациентов с хроническим заболеванием печени обычно изменяется из-за нарушения обмена веществ.Аминокислоты с разветвленной цепью (BCAA) — это валин, лейцин и изолейцин, а молярное отношение BCAA к ароматическим аминокислотам (AAA), известное как отношение Фишера, обычно составляет от 3,0 до 3,5 в плазме [1]. BCAA служат важным источником топлива для периферических тканей у пациентов с циррозом печени [2]. Поскольку повышение уровня AAA в плазме было вызвано усилением деградации мышечного белка и снижением метаболизма в печени, коэффициент Фишера обычно падал ниже 2,0 в соответствии с тяжестью заболевания печени.С другой стороны, человеческий сывороточный альбумин является наиболее распространенным белком плазмы, который составляет около 50% от общего содержания белка, а у пациентов с запущенным циррозом печени наблюдается гипоальбуминемия, вызванная снижением синтеза в гепатоцитах. Синтез и секреция альбумина были самыми высокими, когда первичные гепатоциты культивировали в среде с соответствующим соотношением Фишера 3 [3]. Соответственно, введение пероральной добавки с гранулами BCAA пациентам с циррозом улучшило гипоальбуминемию и прогноз [4] — [6].Кроме того, гепатоцеллюлярная карцинома обычно связана с хроническим вирусным гепатитом и циррозом, и, что более важно, дополнительная терапия BCAA снижает частоту гепатоцеллюлярной карциномы у пациентов с циррозом [7].

Мишень рапамицина у млекопитающих (mTOR) активируется различными стимулами, такими как питательные вещества, энергия, сигналы стресса и факторы роста, чтобы связать клеточный метаболизм с ростом и пролиферацией [8], [9]. mTOR образует два разных мультибелковых комплекса: mTORC1 и mTORC2.mTORC1, который чувствителен к рапамицину, фосфорилирует и активирует киназу p70 S6, а киназа, в свою очередь, фосфорилирует рибосомный белок S6, что приводит к усилению синтеза белка. Активированный mTORC1 также фосфорилирует eIF4E-связывающий белок 1 (4E-BP1) и способствует образованию комплекса инициации синтеза белка. Было показано, что аминокислоты регулируют синтез белка через mTOR [10], а лейцин активирует mTOR в клеточных линиях карциномы печени [11]. Лейцин стимулирует синтез белка в скелетных мышцах и жировой ткани крыс, лишенных пищи, посредством чувствительного к рапамицину пути [12], [13].Следовательно, предполагается, что mTORC1 регулируется аминокислотами [8], [9]. Поскольку BCAA, особенно лейцин, способствуют выработке альбумина в первичных гепатоцитах крысы через систему передачи сигнала mTOR [14], предполагается, что BCAA играют важную роль в метаболических нарушениях, опосредованных путем mTORC1. С другой стороны, mTORC2, который не является ни прямо, ни остро чувствительным к рапамицину и обычно нечувствителен к питательным веществам и энергетическим сигналам, реагирует на факторы роста, такие как инсулин.Инсулин активирует mTORC2, что приводит к активации протеинкиназы B (PKB) / AKT. Активированный PKB / AKT опосредует метаболические действия инсулина, такие как усиление транспорта глюкозы и стимулирование передачи сигналов mTORC1 для управления синтезом белка и ростом клеток. Сообщалось, что дерегуляция нескольких элементов пути mTOR, включая PKB / AKT, PI3K, 4E-BP1, eIF4E, Rheb, S6K1, LKB1, PTEN и TSC1 / TSC2, была обнаружена при многих типах рака [8] , [9].

Клеточное старение было впервые упомянуто как состояние необратимой остановки роста нормальных фибробластов человека, которое называется репликативным старением, потому что теломеры постепенно укорачиваются за счет репликации и в конечном итоге заставляют клетки достигать своего «предела Хейфлика» [15], [16].Старение может быть вызвано различными условиями, такими как аберрантная онкогенная активация, повреждение ДНК и окислительный стресс. Этот тип клеточного старения получил название преждевременного старения. Было высказано предположение, что повреждение ДНК может быть общей причиной различных форм старения, вызванного разными стимулами, включая укорочение теломер [17], [18]. Ответ на повреждение ДНК инициируется образованием фокусов, состоящих из γ-h3AX, 53BP1, NBS1 и MDC1, и приводит к активации ATM / ATR и Chk1 / Chk2, которые, в свою очередь, фосфорилируют и стабилизируют p53 [18].Экспрессия p21 (CIP1 / WAF1), одной из мишеней p53, активируется в стареющих клетках [19], а сверхэкспрессия p21 может вызывать остановку роста, подобную старению, в некоторых клетках [20]. Недавно было высказано предположение, что старение функционирует как эффективный механизм подавления опухоли, предотвращая пролиферацию клеток с риском неопластической трансформации [21] — [25].

Как описано выше, добавка BCAA снижает частоту гепатоцеллюлярной карциномы, сигнальный путь mTOR вносит большой вклад в образование опухоли, а клеточное старение является одним из механизмов подавления опухоли. Однако взаимосвязь между BCAA, сигнальным путем mTOR, клеточным старением и подавлением опухоли остается неясной. В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что клетки, культивируемые в среде BCAA_3, которые имеют коэффициент Фишера 3,12, обладают более высокой активностью по индукции преждевременного старения и повышенной активностью mTORC1. Кроме того, сами BCAA усиливали выполнение преждевременного старения и повышали уровень белка p21, опосредованного путем mTORC1. Эти результаты показывают, что добавление BCAA, возможно, предотвращает образование опухолей за счет усиления клеточного старения, опосредованного сигнальным путем mTOR.

Материалы и методы

Культивирование клеток и условия обработки

HepG2 (линия гепатоцеллюлярной карциномы человека) были подарком доктора С. Шимицу [26]. Клетки U2OS (линия остеосаркомы человека) были приобретены в ATCC. Клетки HepG2 и U2OS культивировали в среде RPMI 1640 (Gibco Life Technologies) и среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (Wako), соответственно, с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS). В среду BCAA на основе PRMI, содержащую различные количества BCAA, суммированные в таблице 1, добавляли 10% FBS, который подвергали диализу против фосфатно-солевого буфера (PBS) для удаления остаточных аминокислот.Для анализа ассоциированной со старением β-галактозидазы (SA-β-Gal) и иммуноблот-анализа клетки HepG2 и U2OS предварительно культивировали в среде BCAA_1 за день до обработки этопозидом (Sigma) и блеомицином (Wako). Рапамицин (Calbiochem) добавляли в среду за 1 час до добавления этопозида и блеомицина.

Окрашивание β-галактозидазой, ассоциированное со старением

Клетки, выращенные в 35-мм чашках или 12-луночных планшетах, дважды промывали PBS, фиксировали 2% формальдегидом / 0,2% глутаральдегидом в PBS в течение 5 мин при комнатной температуре и дважды промывали PBS.После инкубации с окрашивающим раствором SA-β-Gal [1 мг / мл 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактозида, 40 мМ лимонная кислота / фосфат натрия (pH 6,0), 5 мМ ферроцианид калия, 5 мМ феррицианид калия, 150 мМ хлорид натрия, 2 мМ хлорид магния] при 37 ° C в течение 12-24 часов, клетки исследовали под флуоресцентным микроскопом (модель BZ-8000; Keyence). Стареющие клетки были идентифицированы как окрашенные в синий цвет клетки с фазовым контрастом, и всего 200 клеток были подсчитаны в 15 случайных полях для определения процента SA-β-Gal положительных клеток.

БрДУ инкорпорация

клеток U2OS метили 10 мкМ 5-бром-2-дезоксиуридина (BrdU, Sigma) в течение 3 часов. Для иммуноокрашивания BrdU клетки фиксировали 4% параформальдегидом в PBS и повышали проницаемость 0,5% TritonX-100. ДНК гидролизовали путем воздействия на клетки 2 н. HCl в течение 10 мин, а затем клетки инкубировали с антителом против BrdU (BD Pharmingen, 555627) в растворе иммуноокрашивания Can Get Signal (TOYOBO) в течение ночи при 4 ° C с последующей инкубацией с Alexa. Вторичные антитела, конъюгированные с Fluor 488 (молекулярные зонды), в течение 1 ч при комнатной температуре.После окрашивания ядер Hoechst 33258 клетки исследовали под флуоресцентным микроскопом.

Антитела

Были получены поликлональные антитела против фосфо-p53 (Ser15) (9284), поликлональные антитела против фосфо-Akt (Ser473) (9271) и моноклональные антитела против фосфо-p70 S6-киназы (Thr389) (1A5) (9206). от Cell Signaling Technology; моноклональное антитело против p53 (DO-1) (sc-126) и поликлональное антитело против p70 S6 киназы (c-18) (sc-230) были от Santa Cruz Biotechnology; моноклональное антитело против p21WAF1 / CIP1 (K0081-3) было получено из медицинских и биологических лабораторий; поликлональное антитело против Akt (559028) было от BD Pharmingen; моноклональное антитело против α-тубулина (T6074) было от Sigma.

Иммуноблот-анализ

Клетки лизировали в ледяном буфере для лизиса [50 мМ трис-HCl (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 20 мМ NaF, 20 мМ β-глицерофосфат, 1% Nonidet P-40, 1% лаурилсульфат натрия, 10 мкг. / мл фенилметансульфонилфторида, 5 мМ ЭДТА, 10 мкг / мл апротинина, 10 мкг / мл лейпептина]. Равные количества белка из всех экстрактов клеток смешивали с буфером для образцов, содержащим меркаптоэтанол, и нагревали в течение 10 минут при 97 ° C. Образцы белков разделяли электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле и наносили на поливинилидендифторидную мембрану Immobilon (Millipore). Каждый белок детектировали с использованием первичного антитела, как указано, вторичного антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена, и реагента для обнаружения ECL (GE Healthcare), и интенсивность каждой полосы белка количественно определяли с помощью ImageJ.

ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

Тотальную РНК выделяли из клеток HepG2 с использованием NucleoSpin® RNA II (Takara). ПЦР-амплификацию выполняли с использованием специфических праймеров для p21 , 5′-CGACTGTGATGCGCTAATG-3 ‘и 5′-TCTCGGTGACAAAGTCGAAG-3’, а для GAPDH , 5′-CAATGACCCCTTTCATTGACTC-3GACG ‘и 5’CTAGTCTGACTC-3GACG’ и 5’CTAGTC ‘-.Продукты ПЦР разделяли электрофоретически на агарозном геле и окрашивали бромидом этидия для визуализации.

Результаты

Препараты, вызывающие повреждение ДНК, вызывают преждевременное старение

Для анализа взаимосвязи между BCAA и образованием опухоли мы использовали две линии опухолей человека, клетки гепатокарциномы HepG2 и клетки остеосаркомы U2OS. Поскольку обе клеточные линии имеют ген р53 дикого типа, ожидается, что он будет нормально реагировать на повреждение ДНК. Сообщалось, что препараты, вызывающие повреждение ДНК, могут вызывать старение опухолевых клеток [27], [28].Поэтому мы решили подтвердить, вызывают ли этопозид и блеомицин преждевременное старение в клетках HepG2 и U2OS (рис. 1). После обработки клеток HepG2 10 мкМ этопозида в течение 2 дней мы наблюдали клетки, показывающие остановку пролиферации и увеличение морфологии клеток (данные не показаны), которые представляют типичные особенности стареющих клеток. Поскольку SA-β-Gal является широко используемым биомаркером старения [29], мы оценили влияние этопозида на активность SA-β-Gal клеток HepG2 (рис. 1A).Активность SA-β-Gal постепенно увеличивалась в зависимости от времени, и около 80% клеток показали положительный результат по SA-β-Gal в течение 48 часов. Чтобы подтвердить, индуцируется ли старение этопозидом, мы применили анализ старения к линии клеток остеосаркомы человека, U2OS (рис. 1В). Хотя более низкой дозы этопозида, 2 мкМ, было достаточно, чтобы вызвать старение, для проявления активности SA-β-Gal требовались более длительные периоды. В любом случае, клетки U2OS, обработанные этопозидом, наконец, проявляли черты стареющих клеток, включая остановку клеточного цикла, увеличенную морфологию и активность SA-β-Gal в течение 7 дней (рис. 1B).Кроме того, другое лекарство, вызывающее повреждение ДНК, блеомицин, способ действия которого отличается от этопозида и индуцирует двухцепочечные разрывы ДНК, также индуцировал преждевременное старение в клетках U2OS (рис. 1B). Эти результаты предполагают, что этопозид и блеомицин могут вызывать преждевременное старение в клетках HepG2 и U2OS.

Рис. 1. Лекарства, вызывающие повреждение ДНК, вызывают преждевременное старение.

(A) Клетки HepG2 культивировали в среде RPMI с 0,1% ДМСО или 10 мкМ этопозидом в течение 0, 12, 24, 36 и 48 часов.(B) Клетки U2OS культивировали в среде RPMI с 0,1% ДМСО, 2 мкМ этопозида или 2 мкМ блеомицина в течение 0, 3, 5 и 7 дней. Для анализа активности SA-β-Gal клетки, окрашенные синим цветом, подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». Данные (среднее ± стандартное отклонение) были получены как минимум в трех независимых экспериментах. Показаны важные результаты испытаний (значения P ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0080411.g001

Клетки, культивируемые в среде BCAA_3, обладают более высокой активностью по индукции преждевременного старения

Чтобы изучить влияние BCAA на индукцию преждевременного старения, мы приготовили среду на основе RPMI, содержащую различные соотношения Фишера (Таблица 1).Клетки HepG2, культивированные в среде с различным соотношением Фишера, обрабатывали этопозидом (рис. 2A и B) и блеомицином (рис. 2C), чтобы вызвать преждевременное старение. Отношение SA-β-Gal положительных клеток было самым высоким, когда клетки культивировали в среде BCAA_3 с коэффициентом Фишера 3,12 (рис. 2A, B и C), что позволяет предположить, что индукция преждевременного старения клеток HepG2, индуцированная этопозидом и блеомицин был усилен средой, содержащей BCAA с коэффициентом Фишера около 3. Чтобы подтвердить эти результаты, клетки U2OS, культивированные в среде от BCAA_1 до BCAA_5, обрабатывали этопозидом (рис. 2D). Клетки U2OS, культивированные в среде BCAA_3, в которой включение BrdU существенно не отличалось от BCAA_1 и _5 (фиг. 3), имели наивысшее соотношение SA-β-Gal положительных клеток. Эти результаты свидетельствуют о том, что преждевременное старение клеток HepG2 и U2OS, индуцированное лекарствами, вызывающими повреждение ДНК, усиливается при культивировании в среде, имеющей коэффициент Фишера 3.12.

Рис. 2. Клетки, культивируемые в среде BCAA_3, обладают более высокой активностью по индукции преждевременного старения.

(A) Клетки HepG2, культивированные в BCAA_1, 3, 5 и BCAA_5 со 100 нМ рапамицином, обрабатывали 10 мкМ этопозидом в течение 2 дней и наблюдали под микроскопом после анализа окрашивания SA-β-Gal. (B, C) Клетки HepG2, культивированные в среде BCAA с или без 100 нМ рапамицина, как указано, обрабатывали 10 мкМ этопозидом (B) или 2 мкМ блеомицином (C) в течение 2 дней. (D) Клетки U2OS, культивированные в среде на основе RPMI со 100 нМ рапамицином или без него, как указано, обрабатывали 2 мкМ этопозидом в течение 7 дней.Для анализа активности SA-β-Gal клетки, окрашенные синим цветом, подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». Данные (среднее ± стандартное отклонение) были получены как минимум в трех независимых экспериментах. Показаны важные результаты испытаний (значения P ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0080411.g002

Рис. 3. Среда BCAA не влияет на пролиферацию клеток.

Клетки U2OS, культивированные в среде BCAA в течение 7 дней, метили 10 мкМ BrdU в течение 3 часов.Клетки, меченные BrdU, наблюдали под микроскопом после иммуноокрашивания на BrdU и окрашивание Heochst (слева), и количественно определяли процент BrdU-положительных клеток (справа). Данные (среднее ± стандартное отклонение) были получены как минимум в трех независимых экспериментах. Показаны значимые результаты испытаний.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0080411.g003

Затем мы исследовали эффекты рапамицина, специфического ингибитора mTOR, на усиление BCAA на выполнение преждевременного старения, поскольку об этом сообщалось что BCAA стимулируют активность mTOR [10], [11].Добавление рапамицина в среду уменьшало усиление преждевременного старения BCAA в клетках HepG2 (рис. 2A, B и C). Кроме того, обработка клеток U2OS, культивируемых в среде RPMI, имеющей коэффициент Фишера 3,7 (таблица 1), рапамицином эффективно предотвращала выполнение преждевременного старения, индуцированного этопозидом (фигура 2D). Эти результаты предполагают, что сигнальный путь mTOR способствует преждевременному старению, вызванному лекарствами, вызывающими повреждение ДНК.

Клетки, культивируемые в среде BCAA_3, обладают более высокой активностью mTOR и более высокими уровнями белка p21

Чтобы подтвердить, стимулируют ли BCAA активность mTOR в условиях, в которых клетки обрабатывали этопозидом для индукции преждевременного старения, оценивали фосфорилирование S6K по Thr389, субстрату mTORC1 (рис. 4A). Хотя фосфорилирование S6K Thr389 наблюдалось в клетках, культивированных в среде с BCAA_1 по BCAA_5, уровни фосфорилирования были максимальными в BCAA_3, а фосфорилирование подавлялось рапамицином, что позволяет предположить, что mTORC1 активировался в этих условиях и имел самую высокую активность в среде BCAA_3.Поскольку сообщалось, что mTORC1 стимулирует синтез белка [8], [9], а p21, ингибитор циклин-зависимой киназы, может опосредовать клеточное старение [19], [20], уровень экспрессии белка p21 оценивался в клетках, культивируемых с каждая среда BCAA после обработки этопозидом (рис. 4В). Хотя белок p21 был обнаружен в клетках, культивируемых с помощью BCAA_1 — BCAA_5, поскольку p21 является геном, чувствительным к повреждению ДНК, уровень белка p21 в среде BCAA_3 был выше, чем в другой среде BCAA.Кроме того, белок p21 заметно снижался в присутствии рапамицина даже в присутствии этопозида, что указывает на то, что уровень экспрессии p21 регулируется посредством пути mTORC1. Чтобы подтвердить, опосредуется ли повышающая регуляция белка p21 трансляцией, но не транскрипцией, сравнивали уровни мРНК p21 (рис. 4C). Уровень мРНК для p21 резко увеличился после лечения этопозидом, что согласуется с предыдущими сообщениями о том, что транскрипция p21 была вызвана генотоксическим стрессом [30], [31].Однако аналогичные уровни мРНК p21 наблюдались в BCAA_1 и BCAA_3, и, что более важно, рапамицин не влиял на транскрипцию p21 . Эти результаты свидетельствуют о том, что усиление клеточного старения, культивируемого в среде BCAA_3, опосредуется активацией белка p21 через путь mTORC1.

Рис. 4. Клетки, культивируемые в среде BCAA_3, обладают более высокой активностью mTOR и более высокими уровнями белка p21.

(A) Клетки HepG2, культивированные в среде BCAA со 100 нМ рапамицином или без него, как указано, обрабатывали 10 мкМ этопозидом в течение 48 часов.Лизаты клеток подвергали SDS-PAGE и иммуноблоттингу с указанными антителами. Интенсивность полос, соответствующих фосфорилированному S6K по Thr389 и S6K, была количественно определена с помощью ImageJ, и отношение фосфорилированного S6K по Thr389 к S6K было показано как активности mTORC1. (B) Клетки HepG2, культивированные в среде BCAA со 100 нМ рапамицином или без него, как указано, обрабатывали 10 мкМ этопозидом в течение 48 часов. Лизаты клеток подвергали SDS-PAGE и иммуноблоттингу с указанными антителами.Интенсивность полос, соответствующих p21 и α-тубулину, была количественно определена с помощью ImageJ, и было показано соотношение p21 и α-тубулина. (C) Клетки HepG2, культивированные в среде BCAA, обрабатывали 10 мкМ этопозида и 100 нМ рапамицина или без них, как указано, в течение 48 часов. Экспрессию мРНК p21 и GAPDH исследовали с помощью ОТ-ПЦР с использованием специфических праймеров против p21 и GAPDH . Интенсивность полос, соответствующих p21 и GAPDH , была количественно определена ImageJ, и было показано отношение p21 к GAPDH .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0080411.g004

BCAA усиливают преждевременное старение, вызванное лекарствами, вызывающими повреждение ДНК

Как описано выше, клетки, культивируемые в среде BCAA_3, имели более высокую активность в отношении преждевременного старения, опосредованного mTOR, по сравнению с клетками, культивированными в среде BCAA_1, 2, 4 и 5. Однако различия были не очень высокими, и неясно, были ли эффекты были вызваны BCAA, потому что каждая среда содержала различное количество BCAA, которые могли активировать mTOR, по крайней мере, на базовых уровнях.Таким образом, мы исследовали активность BCAA для усиления выполнения преждевременного старения и стимуляции активности киназы mTOR по сравнению с клетками, культивированными в BCAA_3, с клетками в BCAA_0, которые не содержали BCAA (Рисунок 5 и Таблица 1). Клетки HepG2, культивированные в BCAA_0 и BCAA_3, обрабатывали этопозидом для индукции преждевременного старения и оценивали активность SA-β-Gal (фиг. 5A и B). Интересно, что активность по индукции преждевременного старения в клетках, культивируемых в BCAA_0, была значительно снижена по сравнению с таковой в BCAA_3, а активность подавлялась рапамицином.Аналогичные результаты были получены при использовании клеток U2OS (рис. 5C и D). Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что BCAA и mTORC1 способствуют преждевременному старению, вызванному лекарствами, вызывающими повреждение ДНК.

Рис. 5. BCAA усиливают преждевременное старение, вызванное лекарствами, вызывающими повреждение ДНК.

(A) Клетки HepG2, культивированные в среде BCAA, обрабатывали 10 мкМ этопозида и 100 нМ рапамицина или без них, как указано, в течение 48 часов и наблюдали под микроскопом после анализа окрашивания SA-β-Gal.(B) Клетки HepG2 культивировали в BCAA, как описано в A. Для анализа активности SA-β-Gal клетки, окрашенные синим цветом, подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». Данные (среднее ± стандартное отклонение) были получены как минимум в трех независимых экспериментах. Показаны важные результаты испытаний (значения P ). (C) Клетки U2OS, культивированные в среде BCAA, обрабатывали 2 мкМ этопозида и 100 нМ рапамицина или без них, как указано, в течение 7 дней и наблюдали под микроскопом после анализа окрашивания SA-β-Gal.(D) Клетки U2OS культивировали в среде BCAA, как описано в C. Анализ активности SA-β-Gal проводили, как описано в B. (E) Клетки U2OS, культивируемые в среде BCAA, обрабатывали 100 нМ рапамицина или без него, как указано в течение 24 часов, и клетки собирали в каждый момент времени. Лизаты клеток подвергали SDS-PAGE и иммуноблоттингу с указанными антителами.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0080411.g005

Чтобы подтвердить, активировался ли mTORC1 в клетках, культивируемых в BCAA_3, но не в BCAA_0, в условиях, при которых препараты, вызывающие повреждение ДНК, были исключены во избежание Эффект ответа повреждения ДНК на активность mTOR оценивали фосфорилирование S6K по Thr389 (фиг. 5E).Слабая полоса, соответствующая фосфорилированию S6K Thr389, была обнаружена в среде BCAA_0 через 0 мин, и полоса была обнаружена даже через 1 день, предполагая, что слабая активность mTORC1 сохранялась, несмотря на отсутствие BCAA. Поскольку фосфорилирование S6K по Thr389 было повышено в клетках, культивируемых в среде BCAA_3, и эффективно подавлялось рапамицином, активность mTORC1 была явно выше в BCAA_3, чем в BCAA_0. В совокупности эти результаты показали, что сами BCAA повышают активность mTORC1 в клетках.

BCAA повышают уровень белка p21, опосредованного путем mTORC1

Затем мы исследовали взаимосвязь между ответом на повреждение ДНК и активностью mTOR (рис. 6). Клетки HepG2, культивированные в нормальной среде RPMI, содержащей BCAA с коэффициентом Фишера 3,7 (таблица 1), обрабатывали этопозидом или без него, и активность mTORC1 и mTORC2 оценивали по фосфорилированию S6K по Thr389 в качестве субстрата mTORC1 и фосфорилированию Akt при Ser473 в качестве субстрата mTORC2 соответственно (рис. 6А).Фосфорилированные полосы S6K по Thr389 были обнаружены и исчезли при обработке рапамицином, тогда как фосфорилирование Akt по Ser473 наблюдалось с более низкими уровнями, которые были устойчивыми к рапамицину. Однако на активность как mTORC1, так и mTORC2 не влияла обработка этопозидом, что позволяет предположить, что сами пути mTOR не участвуют в ответе на повреждение ДНК. Напротив, фосфорилирование p53 по Ser15, которое, как предполагалось, является ответом на различные агенты повреждения ДНК [32], было повышено после обработки этопозидом, что указывает на то, что реакция повреждения ДНК обычно продолжалась, чтобы активировать p53, а фосфорилирование не зависело от рапамицина. .Эти результаты предполагают, что сайт действия mTORC1 в ответе на повреждение ДНК в этих условиях находится ниже p53.

Рис. 6. BCAA повышают уровень белка p21, опосредованного путем mTORC1.

(A) Клетки HepG2, культивированные в среде RPMI, обрабатывали 10 мкМ этопозида и 100 нМ рапамицина или без них, как указано, в течение 1 или 2 дней. Лизаты клеток подвергали SDS-PAGE и иммуноблоттингу с указанными антителами. (B) Клетки HepG2, культивированные в среде BCAA, обрабатывали 10 мкМ этопозида и 100 нМ рапамицина или без них, как указано, в течение 2 дней.Лизаты клеток подвергали SDS-PAGE и иммуноблоттингу с указанными антителами.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0080411.g006

Среди генов-мишеней p53, p21 является хорошо известным геном, необходимым для выполнения преждевременного старения, и уровень белка p21 был выше. в клетках, культивируемых в BCAA_3, чем в другой среде, содержащей BCAA (рис. 4C). Поэтому мы решили изучить влияние самих BCAA на уровни белка p21 по сравнению с клетками, культивированными в BCAA_3, с клетками в BCAA_0, которые не содержали BCAA (рис. 6B).Уровни белка p53 не изменились в клетках, обработанных этопозидом или без него, в то время как p53 в клетках, культивируемых в BCAA_3, был выше, чем в BCAA_0, что может быть индуцировано усиленной трансляцией в присутствии BCAA. С другой стороны, фосфорилирование p53 по Ser15, которое, как ожидалось, повысит транскрипционную активность, было обнаружено только в клетках, обработанных этопозидом, и уровни фосфорилирования p53, по-видимому, не изменились, поскольку они были параллельны их уровням белка, хотя наличие рапамицина.Эти результаты свидетельствуют о том, что путь mTORC1 в значительной степени не влияет на p53, что согласуется с результатами на рисунке 6A. Напротив, уровень белка p21 сильно увеличивался повреждением ДНК только в присутствии BCAA, а повышение уровня белка p21 подавлялось рапамицином. Взятые вместе, эти результаты показывают, что BCAA положительно регулируют преждевременное старение, активируя белок p21 через путь mTORC1.

Обсуждение

В настоящем исследовании мы оценили влияние BCAA на выполнение преждевременного старения, вызванного ответом на повреждение ДНК.Результаты показали, что клетки, культивируемые в среде, содержащей BCAA с коэффициентом Фишера 3,12, обладают более высокой активностью по индукции преждевременного старения. Поскольку mTORC1 был активирован, а p21 усиливался самими BCAA, выполнение преждевременного старения, индуцированного лекарствами, вызывающими повреждение ДНК, по-видимому, усиливалось BCAA, опосредованным через сигнальные пути mTORC1.

Поскольку некоторые опухолевые супрессоры, такие как p53, p21, p16, Arf и pRB, действуют как регуляторы старения, было высказано предположение, что старение действует как важный механизм подавления опухоли [33], [34].Кроме того, большинство раковых клеток человека приобрели способность к постоянной пролиферации за счет реактивации теломеразы [35], что указывает на связь между контрольной точкой теломер и подавлением опухоли. Хотя эктопической экспрессии обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT) в нормальных клетках человека было достаточно для иммортализации клеток и повышения способности индуцировать неопластическую трансформацию [36], [37], а трансгенные мыши со сверхэкспрессией TERT были склонны к онкогенезу [38], [ 39], ингибирование теломеразы в раковых клетках ограничивает пролиферацию за счет укорачивания теломер и гибели клеток [40], [41].Более того, было показано, что старение, индуцированное укорочением теломер, является эффективным механизмом подавления опухоли in vivo [21], [22]. Кроме того, стареющие клетки были обнаружены в предраковых поражениях или доброкачественных тканях, вызванных активацией различных онкогенов или инактивацией опухолевых супрессоров, но не в злокачественных опухолях [23] — [25]. Эти результаты предполагают, что клеточное старение является мощным механизмом подавления опухоли за счет ограничения пролиферации клеток и обеспечивает привлекательный терапевтический вариант лечения рака, если его можно вызвать в опухолевых клетках.Согласно этой теории, были опробованы методы лечения рака, вызывающие старение путем ингибирования теломеразы [42]. В дополнение к стратегии ингибирования теломеразы в качестве терапевтических мишеней, обычные химиотерапевтические препараты, которые вызывают повреждение ДНК, могут вызывать старение в различных типах опухолевых клеток в культуре и in vivo [27], [28]. В соответствии с этими наблюдениями мы показали, что этопозид и блеомицин, химиотерапевтические препараты, вызывающие повреждение ДНК, вызывают старение в линиях опухолей человека, клетках HepG2 и U2OS.Что еще более важно, лечение химиотерапевтическими препаратами в сочетании с BCAA усиливало преждевременное старение. Поскольку стареющие клетки были обнаружены в опухолях человека после химиотерапии [27], добавление BCAA в химиотерапию может быть полезным для повышения терапевтической эффективности. Более того, поскольку укорочение теломер вызывает старение, опосредующее повреждение ДНК [17], [18], добавление BCAA также может быть применимо для лечения рака путем ингибирования теломеразы.

Низкий коэффициент Фишера является физиологическим признаком цирроза печени, и добавка BCAA изначально была разработана для нормализации аминокислотного профиля и статуса питания пациентов.Недавние исследования показали, что добавление BCAA улучшает не только пищевой статус, но также прогноз и качество жизни пациентов с циррозом печени. Кроме того, добавление BCAA было предложено для предотвращения случаев гепатоцеллюлярной карциномы у пациентов с циррозом печени [5] — [7]. Сообщалось об одном возможном объяснении молекулярных механизмов BCAA для предотвращения заболеваемости раком, в котором BCAA ингибировали индуцированную инсулином пролиферацию опухолевых клеток печени, вызывая апоптоз за счет активности mTORC1 и mTORC2 [43].Кроме того, мы продемонстрировали здесь еще один возможный механизм добавления BCAA для снижения заболеваемости раком. Поскольку BCAA могут усиливать выполнение преждевременного старения, опосредованного посредством активности mTORC1, для повышения регуляции белка p21, предотвращение случаев гепатоцеллюлярной карциномы при циррозе печени с помощью добавления BCAA может осуществляться несколькими различными механизмами, включая индукцию апоптоза и старения.

Было высказано предположение, что p53 является привлекательной мишенью для индукции старения в раковых клетках, потому что p53 является центральным участником процесса старения и обычно мутирует в раковых клетках.Хотя были опробованы различные подходы к нацеливанию на p53, чтобы восстановить нормальную функцию p53 в раковых клетках, в большинстве случаев апоптоз является заметной реакцией, ответственной за подавление опухоли. Однако сообщалось, что старение функционирует как механизм подавления опухоли после восстановления p53 [44], [45]. Здесь мы показали, что BCAA усиливают старение, вызванное повреждением ДНК, опосредованным путем mTORC1, для усиления трансляции p21. Экспрессия p21 была усилена в стареющих клетках, а сверхэкспрессия p21 могла индуцировать признаки стареющего фенотипа [19], [20], в то же время предполагалось, что экспрессия p21 не требуется для старения [46].Следовательно, p53 может регулировать клеточное старение, вызванное повреждением ДНК, по крайней мере частично, за счет активации транскрипции p21 . Поскольку ожидается, что регуляция белкового синтеза, опосредованная путем mTOR, будет влиять на широкий спектр генов, будет важно идентифицировать гены, необходимые для старения, транскрипция и трансляция которых регулируются p53 и mTOR, соответственно.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: SI SK.Проведены опыты: МН ТН СК. Проанализированы данные: МН АН ТН СК. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: MN UK SK. Написал статью: МН ТН СК.

Ссылки

1. 1. Фишер Дж. Э., Йошимура Н., Агирре А., Джеймс Дж. Х., Каммингс М. Г. и др. (1974) Аминокислоты плазмы у пациентов с печеночной энцефалопатией: эффекты инфузий аминокислот. Am J Surg 127: 40–47.
2. 2. McCullough AJ, Czaja AJ, Jones JD, Go VL (1981) Природа и прогностическое значение серийных определений аминокислот при тяжелом хроническом активном заболевании печени.Гастроэнтерология 81: 645–652.
3. 3. Okuno M, Moriwaki H, Kato M, Muto Y, Kojima S (1995) Изменения в соотношении аминокислот с разветвленной цепью и ароматических аминокислот влияют на секрецию альбумина в культивируемых гепатоцитах крысы. Biochem Biophys Res Commun 214: 1045–1050.
4. 4. Yoshida T, Muto Y, Moriwaki H, Yamato M (1989) Влияние длительного перорального приема с гранулами аминокислот с разветвленной цепью на прогноз цирроза печени. Гастроэнтерол Jpn 24: 692–698.
5. 5. Marchesini G, Marzocchi R, Noia M, Bianchi G (2005) Добавки аминокислот с разветвленной цепью у пациентов с заболеваниями печени. J Nutr 135: 1596S – 1601S.
6. 6. Муто Й., Сато С., Ватанабэ А., Мориваки Х., Сузуки К. и др. (2005) Влияние пероральных гранул аминокислот с разветвленной цепью на выживаемость без событий у пациентов с циррозом печени. Clin Gastroenterol Hepatol 3: 705–713.
7. 7. Муто Й., Сато С., Ватанабэ А., Мориваки Х., Сузуки К. и др.(2006) Избыточный вес и ожирение увеличивают риск рака печени у пациентов с циррозом печени, а длительный пероральный прием гранул аминокислот с разветвленной цепью подавляет канцерогенез печени у более тяжелых пациентов с циррозом печени. Hepatol Res 35: 204–214.
8. 8. Zoncu R, Efeyan A, Sabatini DM (2011) mTOR: от интеграции сигнала роста до рака, диабета и старения. Nat Rev Mol Cell Biol 12: 21–35.
9. 9. Популо Х., Лопес Дж. М., Соарес П. (2012) Путь передачи сигналов mTOR при раке человека.Int J Mol Sci 13: 1886–1918.
10. 10. Hara K, Yonezawa K, Weng QP, Kozlowski MT, Belham C, et al. (1998) Достаточность аминокислот и mTOR регулируют киназу p70 S6 и eIF-4E BP1 через общий эффекторный механизм. J Biol Chem 273: 14484–14494.
11. 11. Сигэмицу К., Цудзишита Ю., Мияке Х., Хидаят С., Танака Н. и др. (1999) Структурная потребность лейцина для активации киназы p70 S6. FEBS Lett 447: 303–306.
12. 12. Энтони Дж. К., Йошизава Ф., Энтони Т. Г., Вари Т. К., Джефферсон Л. С. и др.(2000) Лейцин стимулирует инициацию трансляции в скелетных мышцах постабсорбтивных крыс посредством чувствительного к рапамицину пути. J Nutr 130: 2413–2419.
13. 13. Линч С.Дж., Патсон Б.Дж., Энтони Дж., Вавал А., Джефферсон Л.С. и др. (2002) Лейцин — это питательный сигнал прямого действия, регулирующий синтез белка в жировой ткани. Am J Physiol Endocrinol Metab 283: E503–513.
14. 14. Ijichi C, Matsumura T, Tsuji T, Eto Y (2003) Аминокислоты с разветвленной цепью способствуют синтезу альбумина в первичных гепатоцитах крысы через систему передачи сигнала mTOR.Biochem Biophys Res Commun 303: 59–64.
15. 15. Hayflick L, Moorhead PS (1961) Серийное культивирование штаммов диплоидных клеток человека. Exp Cell Res 25: 585–621.
16. 16. Harley CB, Futcher AB, Greider CW (1990) Теломеры укорачиваются при старении фибробластов человека. Nature 345: 458–460.
17. 17. D’Adda di Fagagna F (2008) Жизнь на разрыве: клеточное старение как реакция на повреждение ДНК. Нат Рев Рак 8: 512–822.
18. 18. Kuilman T, Michaloglou C, Mooi WJ, Peeper DS (2010) Суть старения.Genes Dev 24: 2463–2479.
19. 19. Brown JP, Wei W, Sedivy JM (1997) Обход старения после нарушения гена p21CIP1 / WAF1 в нормальных диплоидных фибробластах человека. Наука 277: 831–834.
20. 20. McConnell BB, Starborg M, Brookes S, Peters G (1998). Ингибиторы циклин-зависимых киназ вызывают особенности репликативного старения в диплоидных фибробластах человека раннего пассажа. Curr Biol 8: 351–354.
21. 21. Feldser DM, Greider CW (2007) Короткие теломеры ограничивают прогрессирование опухоли in vivo, вызывая старение.Cancer Cell 11: 461–469.
22. 22. Косме-Бланко В., Шен М.Ф., Лазар А.Дж., Патак С., Лозано Г. и др. (2007) Дисфункция теломер подавляет спонтанный туморогенез in vivo, инициируя p53-зависимое клеточное старение. EMBO Rep 8: 497–503.
23. 23. Брейг М., Ли С., Лодденкемпер С., Рудольф С., Петерс А.Х. и др. (2005) Онкоген-индуцированное старение как начальный барьер в развитии лимфомы. Природа 436: 660–665.
24. 24. Чен З., Тротман Л.С., Шаффер Д., Линь Х.К., Дотан З.А. и др.(2005) Решающая роль p53-зависимого клеточного старения в подавлении Pten-дефицитного туморогенеза. Природа 436: 725–730.
25. 25. Michaloglou C, Vredeveld LC, Soengas MS, Denoyelle C, Kuilman T. и др. (2005) Связанная с BRAFE600 остановка клеточного цикла невусов человека, похожая на старение. Природа 436: 720–724.
26. 26. Хасегава Дж., Камада С., Камиике В., Симидзу С., Имадзу Т. и др. (1996) Участие CPP32 / Yama (-подобных) протеаз в Fas-опосредованном апоптозе. Cancer Res.56: 1713–1718.
27. 27. te Poele RH, Окороков А.Л., Джардин Л., Каммингс Дж., Джоэл С.П. (2002) Повреждение ДНК способно вызывать старение в опухолевых клетках in vitro и in vivo. Cancer Res 62: 1876–1883.
28. 28. Ронинсон И.Б. (2003) Старение опухолевых клеток при лечении рака. Cancer Res 63: 2705–2715.
29. 29. Debacq-Chainiaux F, Erusalimsky JD, Campisi J, Toussaint O (2009) Протоколы для обнаружения активности связанной со старением β-галактозидазы (SA-β Gal), биомаркера стареющих клеток в культуре и in vivo.Nat Protoc 4: 1798–1806.
30. 30. эль-Дейри В.С., Харпер Дж. В., О’Коннор П.М., Велкулеску В.Е., Канман С.Е. и др. (1994) WAF1 / CIP1 индуцируется при p53-опосредованной остановке G1 и апоптозе. Cancer Res 54: 1169–1174.
31. 31. Di Leonardo A, Linke SP, Clarkin K, Wahl GM (1994) Повреждение ДНК запускает длительную p53-зависимую остановку G1 и долгосрочную индукцию Cip1 в нормальных фибробластах человека. Genes Dev 8: 2540–2551.
32. 32. Canman CE, Lim DS, Cimprich KA, Taya Y, Tamai K и др.(1998) Активация киназы ATM ионизирующим излучением и фосфорилирование p53. Science 281: 1677–1679.
33. 33. Кампизи Дж. (2005) Старение клеток, подавление опухолей и старение организма: хорошие граждане, плохие соседи. Ячейка 120: 513–522.
34. 34. Kim WY, Sharpless NE (2006) Регулирование INK4 / ARF при раке и старении. Ячейка 127: 265–275.
35. 35. Ким Н.В., Пятышек М.А., Проуз К.Р., Харли С.Б., Западный доктор медицины и др. (1994) Специфическая связь активности теломеразы человека с бессмертными клетками и раком.Science 266: 2011–2015.
36. 36. Кийоно Т., Фостер С.А., Куп Д.И., Макдугалл Дж.К., Галлоуэй Д.А. и др. (1998) И инактивация Rb / p16INK4a, и активность теломеразы необходимы для иммортализации эпителиальных клеток человека. Природа 396: 84–88.
37. 37. Bodnar AG, Ouellette M, Frolkis M, Holt SE, Chiu CP, et al. (1998) Увеличение продолжительности жизни путем введения теломеразы в нормальные клетки человека. Наука 279: 349–352.
38. 38. Гонсалес-Суарес Э., Сампер Э., Рамирес А., Флорес Дж. М., Мартин-Кабальеро Дж. И др.(2001) Увеличение эпидермальных опухолей и ускоренное заживление кожных ран у трансгенных мышей, сверхэкспрессирующих каталитическую субъединицу теломеразы, mTERT, в базальных кератиноцитах. EMBO J 20: 2619–2630.
39. 39. Artandi SE, Alson S, Tietze MK, Sharpless NE, Ye S и др. (2002) Конститутивная экспрессия теломеразы способствует развитию карциномы молочной железы у стареющих мышей. Proc Natl Acad Sci USA 99: 8191–8196.
40. 40. Хан У.С., Стюарт С.А., Брукс М.В., Йорк С.Г., Итон Э. и др. (1999) Ингибирование теломеразы ограничивает рост раковых клеток человека.Нат Мед 5: 1164–1170.
41. 41. Zhang X, Mar V, Zhou W, Harrington L, Robinson MO (1999) Укорочение теломер и апоптоз в человеческих опухолевых клетках, ингибированных теломеразой. Genes Dev 13: 2388–2399.
42. 42. Harley CB (2008) Теломераза и лечение рака. Нат Рев Рак 8: 167–179.
43. 43. Hagiwara A, Nishiyama M, Ishizaki S (2012) Аминокислоты с разветвленной цепью предотвращают индуцированную инсулином пролиферацию опухолевых клеток печени, вызывая апоптоз через механизмы, зависимые от mTORC1 и mTORC2.J. Cell Physiol 227: 2097–2105.
44. 44. Вентура А., Кирш Д.Г., Маклафлин М.Э., Тувсон Д.А., Гримм Дж. И др. (2007) Восстановление функции p53 приводит к регрессии опухоли in vivo. Природа 445: 661–665.
45. 45. Сюэ В., Зендер Л., Митинг С., Дикинс Р.А., Эрнандо Э. и др. (2007) Старение и очищение опухоли запускаются восстановлением p53 в карциномах печени мышей. Nature 445: 656–660.
46. 46. Medcalf AS, Klein-Szanto AJ, Cristofalo VJ (1996) Экспрессия p21 не требуется для старения фибробластов человека.Cancer Res 56: 4582–4585.