Что дает бса: BCAA – продукт для спортсменов и не только

Содержание

Усилители серия BSA

Все усилители Bonn Elektronik имеют модульную структуру. Отдельные блоки усилителя, такие как СВЧ секции, блок питания и цепи управления разделены, что даёт возможность снизить наводки помех между различными типами сигнала и даёт возможность доступа в места повреждений внутри в случае необхоодимости устранения неисправностей. Для поддержания непрерывной работы с сохранением высоких характеристик, все модели усилителей Bonn Elektronik имеют мощное охлаждение на прямым воздушным потоком проходящим через шкафы. Особенности конструкции всех усилителей Bonn Elektronik удовлетворяют высоким требованиям для военного применения, тем самым одновременно охватывая все гражданские стандарты. Общая база для всех моделей соответствует международным стандартам качества и внутренним требованиям к надёжности. Усилители выгодно отличаются высокой механической прочностью и, следовательно, повышенной надежностью. Таким образом, усилители Bonn Elektronik являются идеальными для использования в мобильных приложениях. Все усилители Bonn Elektronik интегрируются в одну или несколько 19-дюймовых секций. Это даёт возможность расположить группы усилителей в одной стойке. Кроме того другие сопутствующие приборы, такие как источники сигналов, блоки переключателей и т.д. могут быть также легко интегрированы в одну стойку.

Модель	Частотный диапазон	Выходная мощность Pmin/тип., Вт	Усиление мин/тип., дБ	Гармоники вторая/третья, дБн	Питание, ВА	Габариты, 19″ системы	Вес, кг
BSA 0025-75	4 кГц -250 МГц 4 кГц — 9 кГц 9 кГц — 250 МГц	30/40 75/100	44,8/48 ±3 48,8/51 ±2	15/10 20/20	600	3 HU	16
BSA 0025-150	4 кГц -250 МГц 4 кГц — 9 кГц 9 кГц — 250 МГц	60/75 150/200	47,8/51 ±3 51,8/54 ±2	20/12 20/20	700	3 HU	20
BSA 0040-75	4 кГц -400 МГц 4 кГц — 9 кГц 9 кГц — 400 МГц	30/40 75/100	44,8/48 ±3 48,8/51 ±2	15/10 25/20	700	3 HU	21
BSA 0040-150	4 кГц -400 МГц 4 кГц — 9 кГц 9 кГц — 400 МГц	60/75 150/200	47,8/51 ±3 51,8/54 ±2	20/12 15/20	1000	3 HU	22
BSA 0110-100	9 кГц -100 МГц	100/125	50/52 ±2	25/20	440	2 HU	13
BSA 0110-125	9 кГц -100 МГц	125/150	51/53 ±2	20/20	550	2 HU	13
BSA 0110-150	9 кГц -100 МГц	150/175	51,8/54 ±2	20/20	600	3 HU	17
BSA 0110-200	9 кГц -100 МГц	200/230	53/55 ±2	20/20	800	3 HU	27
BSA 0110-250	9 кГц -100 МГц	250/300	54/56 ±2	25/18	900	3 HU	28
BSA 0110-400	9 кГц -100 МГц	400/440	56/58 ±2	20/20	1600	4 HU	37
BSA 0110-500	9 кГц -100 МГц	500/600	57/59 ±2	20/20	2500	5 HU	56
BSA 0110-600	9 кГц -100 МГц	600/700	57,8/60 ±2	20/20	2500	5 HU	58
BSA 0110-1000	9 кГц -100 МГц	1000/1200	60/62 ±2	20/20	400	10 HU	95
BSA 0110-1500	9 кГц -100 МГц	1500/1700	61,8/64 ±2	20/20	10000	24 HU	290
BSA 0122-5000/4000	9 кГц -220 МГц 9 кГц — 100 МГц 100 МГц — 400 МГц	5000/5500 4000/4400	67/70 ±3 67/70 ±3	20/20 20/20	35000	41 HU	600
BSA 0122-10000/8000	9 кГц -220 МГц 9 кГц — 100 МГц 100 МГц — 400 МГц	10000/11000 8000/8800	70/73 ±3 70/73 ±3	20/20 20/20	55000	2х 41 HU	900
BSA 0125-5	9 кГц -250 МГц	5/8	37/39 ±2	20/20	100	2 HU	10
BSA 0125-15	9 кГц -250 МГц	15/25	41,8/44 ±2	20/20	175	2 HU	10
BSA 0125-25	9 кГц -250 МГц	25/30	44/46 ±2	20/20	200	2 HU	10
BSA 0125-75	9 кГц -250 МГц	75/100	48,8/51 ±2	25/20	350	2 HU	13

Смотреть все модели

Снижение уровня пиратства на 10% дает ИТ-индустрии дополнительные 142 млрд долларов

BSA: Снижение уровня пиратства на 10% дает ИТ-индустрии дополнительные 142 млрд долларов

08:18 / 16 Сентября, 20102010-09-16T09:18:29+04:00

Alexander Antipov

Снижение уровня компьютерного пиратства создает положительный эффект для экономики страны, стимулируя поступление дополнительных денежных средств в сферу услуг и продаж информационных технологий. В свою очередь, благодаря этому, создаются новые рабочие места и увеличиваются налоговые отчисления в государственную казну, говорят в антипиратской ассоциации BSA.

Чем быстрее темпы снижения уровня пиратства, тем больший положительный эффект достигается. К данным выводам пришли авторы нового исследования «Экономические преимущества от снижения компьютерного пиратства», проведенного ведущей международной исследовательской группой в сфере информационных технологий IDC и Ассоциацией Производителей Программного Обеспечения (BSA). IDC подсчитала экономический эффект от сокращения компьютерного пиратства на 10% в 42 странах.

Согласно исследованию сокращение уровня компьютерного пиратства в России с 67% на 10% за четыре года позволит к 2013 году создать 5 708 новых рабочих мест в сфере высоких технологий, на $4,199 миллиона увеличить вклад ИТ-сектора в экономику страны и принести дополнительные $317 миллионов в виде налоговых поступлений. Ожидается, что 61% от экономических выгод, полученных, благодаря снижению уровня компьютерного пиратства останется на внутреннем рынке. Кроме того, исследование показало, что улучшения связаны с темпами снижения компьютерного пиратства: если в России пиратство будет снижено на 10% за 2 года вместо четырех, то вклад ИТ-сектора в экономику страны и налоговые поступления будет на 30% выше.

Данное исследование показывает, что сокращение компьютерного пиратства в мире на 10% в течение 4 лет позволило бы увеличить вклад ИТ-отрасли в мировую экономику на $142 миллиарда долларов в 42 странах, при этом более 80% сохранится на внутренних рынках. Подобное снижение уровня компьютерного пиратства позволило бы создать около 500 000 новых рабочих мест в сфере высоких технологий и принесло бы около $32 миллиардов дополнительных налоговых поступлений во всем мире. Кроме того, сокращение уровня компьютерного пиратства на 10% за два года способствует увеличению положительного эффекта на 36%, который в данном случае составит $193 миллиарда вклада ИТ-отрасли и $43 миллиардов новых налоговых поступлений к 2013 году.

Телевизоры следят за нами, шпионы поколения Джеймса Бонда страдают от новых технологий, а неудачный пост в Whatsapp десятилетней давности может привести к тюремному сроку в нашем новом Youtube выпуске.

Поделиться новостью:

BSA Guns: новая пневматическая PCP-винтовка Ultra XL

В прошедшем году британский производитель пневматики сосредоточил свои усилия на пополнении линейки РСР-пневматики. Одним из его новобранцев стала спортивно-охотничья модель Ultra XL.

В качестве прототипа для XL послужила более ранняя ультракомпактная модель Ultra SE, также предназначенная для молодежной стрельбы и вооружения фермеров, и которую разработчик окрестил «мини-суперпушкой». Но в отличие своего предшественника, Ultra XL несколько подросла, на 8 см, приобретя более спортивные черты. Главным изменением является приклад, который стал скелетным и получил литую синтетическую регулируемую щеку, перемещающуся на двух металлических направляющих.

При помощи двух двинтов под ключ-шестигранник ее положение легко и быстро меняется. Удлинился и резервуар для сжатого воздуха (давление 232 бара), а также подверглась улучшением клапанная система. Это позволило увеличить число выстрелов без перезарядки, которое заметно выросло по сравнению с SE и составляет, в зависимости от калибра, от 60 до 80. Клапан резервуара для наполнения сжатым воздухом защищен специальным поворотным кольцом, поскольку РСР-оружие очень чувствительно к попаданию внутрь грязи и пыли. Он расположен впереди, там же, где и стрелочный манометр для контроля величины текущего давления.

В стандартной комплектации винтовка оснащается дульным тормозом сотового типа, крепящимся на холоднокованном стволе при помощи дюймовой резьбы 1/2“ UNF. Дульным тормозом, правда, он называется условно, поскольку служит для лишь предохранения дульной части ствола с резьбой и для снижения влияния турбулентного потока воздуха на пульку в момент покидания ею канала ствола. Альтернативой является уже известное прошедшее испытание временем фирменное устройство для бесшумной стрельбы типа VC. У него можно менять различные типы перегородок, тем самым добиться наиболее эффективной его работы.

Спуск матчевый, полностью регулируемый, прикрыт спусковой скобой несколько непривычной формы, но не портящей дизайн оружия. Интересен также роторный магазин на 10 патронов. Он состоит из стального корпуса с вращающимся внутри пластиковым барабанчиком, который имеет разный цвет, в зависимости от калибра: голубой (.177), красный (.22) или черный (.25). Магазин посажен в ствольную коробку очень низко, благодаря чему не являтся помехой для установки оптики. Отметим еще одно достоинство: у магазина Ultra XL нет специальной защелки, а в своем гнезде он удерживается сильным магнитом, что делает его замену молниеносно быстрой.

Россия занимает 16 место в рейтинге BSA по готовности стран к облачным вычислениям

22 Февраля 2012 14:0222 Фев 2012 14:02 | Поделиться

Согласно данным «Ассоциации производителей программного обеспечения (BSA), Россия заняла 16 место среди 24 стран в новом рейтинге государственного регулирования, влияющего на рост облачных вычислений. Россия опередила в рейтинге Индию, известную высоким уровнем инвестиций в ИТ-сектор, а также динамично развивающиеся рынки Китая и Бразилии. По оценкам экспертов исследовательской группы IDC, объем российского рынка облачных вычислений будет ежегодно расти и достигнет $1,2 млрд уже в 2015 г.

Исследование BSA «Рейтинг готовности стран к облачным вычислениям» (BSA Global Cloud Scorecard) является первым подобным рейтингом по вопросу готовности стран к стимулированию развития глобально-интегрированного рынка облачных вычислений. Рейтинг оценивает законодательные нормы в тех странах, на которые в совокупности приходится 80% мирового рынка информационно-коммуникационных технологий. Рейтинг дает оценку политики этих стран по семи критериям: защита персональных данных, кибербезопасность, киберпреступность, интероперабельность и гармонизация законодательства с международными нормами, свободная торговля, ИТ-инфраструктура.

В пятерку стран с самой развитой политикой в области облачных вычислений вошли Япония, Австралия, Германия, США и Франция. Между развитыми и развивающимися экономиками существует ощутимый разрыв в сфере готовности к переходу к облачным технологиям, отметили в BSA. В Японии, США и ЕС создана фундаментальная правовая база, позволяющая поддерживать рост облачных вычислений, в то время как развивающиеся страны, такие как Китай, Индия и Бразилия, должны провести существенную работу, чтобы интегрироваться в мировой рынок облачных вычислений.

Исследование BSA также показало, что в России сегодня наблюдаются проблемы в обеспечении соблюдения прав интеллектуальной собственности в интернете. Страна пока не является членом соглашения ТРИПС, а российское законодательство в сфере защиты авторских прав в интернете имеет ряд пробелов. Кроме того, проникновение широкополосного доступа в России остается на низком уровне. В то же время, нет подробного плана или финансирования развития национальной инфраструктуры широкополосного доступа.

Неожиданным открытием в ходе исследования стало то, что некоторые из успешных стран оградили себя законами и правилами, которые противоречат законодательству других государств. Так, например, предлагаемое Евросоюзом законодательство в области защиты данных может подорвать потенциальное развитие влияния облачных технологий и их влияние на экономику, говорится в сообщении BSA.

10 простых шагов: Как обеспечить безопасность КИИ

Инфраструктура

В целом, по мнению BSA, тревожным сигналом выглядят препятствующие развитию рынка облачных вычислений во всем мире противоречия, выявленные в ходе исследования в регулировании законодательства в этой сфере в разных странах. Чтобы реализовать весь экономический потенциал «облака», BSA призывает государства к гармонизации своих законодательств для стимулирования свободного перехода информации и данных через национальные границы.

«Преимущества облачных вычислений становятся все более очевидными по мере роста их применения и использования, — отметил президент и генеральный директор BSA Роберт Холлиман. — В условиях глобальной экономики у Вас должна быть возможность получать данные и технологии, необходимые для личного или коммерческого использования с серверов, расположенных в любой точке мира. Но для этого нужны законы и правила, допускающие беспрепятственный переход данных через границы государств. В настоящий момент слишком много стран имеют слишком много разных правил, стоящих на пути торговли цифровыми услугами, в которых мы действительно нуждаемся».

По итогам исследования «Рейтинг готовности стран к облачным вычислениям» BSA предложила государствам всего мира 7 шагов по расширению экономических возможностей м облачными вычислениями: защита конфиденциальности пользователей при одновременном обеспечении свободного потока информации и электронной коммерции; содействие передовой практике кибербезопасности без требования использовать конкретные технологии; организация эффективного правоприменения против киберпреступников; обеспечение надежной защиты и эффективного правоприменения в случае нарушения правил использования облачных технологий; поощрение открытости и взаимодействия между провайдерами облачных технологий и решениями; содействие свободной торговле за счет снижения барьеров и ликвидации преференций для конкретных продуктов или компаний; стимулирование частного сектора к инвестированию в инфраструктуру широкополосной связи, а также содействие обеспечению всеобщего доступа к ней среди граждан.

Татьяна Короткова

Пиратам недоплатили за софт – Газета Коммерсантъ № 85 (4140) от 15.05.2009

Уровень компьютерного пиратства в России по итогам прошлого года снижался, несмотря на начавшийся финансовый кризис, утверждает отраслевая ассоциация BSA. В 2008 году пиратским в России оказалось 68% установленного софта, что почти на 7% меньше, чем годом ранее. Производители легального программного обеспечения недосчитались $4,2 млрд, подсчитала BSA. Российские эксперты называют эти цифры заниженными.

68% программного обеспечения, установленного на персональные компьютеры в России в 2008 году, было нелицензионным, говорится в отчете Международной ассоциации производителей программного обеспечения (BSA). Это на 6,8% ниже, чем в 2007 году (73%). При этом финансовые потери разработчиков софта в России от использования пиратской продукции выросли на 2% — до $4,2 млрд.

В отчете говорится, что Россия уже второй год подряд показывает самое значительное снижение уровня пиратства среди 110 стран. Из них только в 57 государствах уровень пиратства снизился, еще в 16 странах — увеличился. Поскольку мировой рынок ПК рос значительно быстрее в странах с высоким уровнем пиратства, мировой уровень пиратства увеличился на 3% и составил 41% в 2008 году. Россия покинула top-20 стран с самым высоким уровнем использования пиратского программного обеспечения в 2006 году. С 2003 по 2006 год уровень пиратства в России снизился с 87% до 80%.

Уровень компьютерного пиратства в странах БРИК (Бразилия, Россия, Индия, Китай) составил 73%, что на 2% ниже, чем в 2007 году. При этом самый высокий уровень пиратства в странах БРИК был зафиксирован в Китае (79%), самый низкий — в Бразилии (58%). Уровень пиратства на Украине в 2008 году вырос на 1% и составил 84%, что соответствует уровню 2006 года. В ЕС показатель составил 35%.

Страны с самым низким уровнем компьютерного пиратства остались прежними: США (20%), Люксембург (21%), Новая Зеландия (22%), Япония (21%). Несмотря на снижение уровня пиратства в США на 1%, потери правообладателей выросли до $9 млрд. Самый высокий уровень пиратства зафиксирован в Грузии (95%), Армении (92%), Бангладеш (92%), Зимбабве (92%), Молдавии (90%), Азербайджане (90%) и Шри-Ланке (90%).

В BSA считают, что уровень пиратства в России снизился благодаря программам по легализации со стороны государства и правообладателей, приведению российских законов по интеллектуальной собственности в соответствие с международными договорами TRIPS и WIPO. Позитивное влияние также оказала «активная жизненная позиция российских правоохранительных органов» и внедрение схемы дистрибуции компьютеров с предустановленной операционной системой (то есть ее стоимость включена в стоимость ПК), говорится в отчете BSA.

Аналитик ИК «Финам» Татьяна Менькова считает, что снижение уровня пиратства в России для отечественных разработчиков мало что меняет. «Наши разработчики больше ориентированы на нишевый софт, наиболее емкие рынки сбыта которого находятся за пределами России»,— говорит госпожа Менькова. По ее словам, снижение уровня пиратства позволит несколько больше зарабатывать на родном рынке, но для разработки ключевыми факторами являются наличие и стоимость квалифицированных кадров, а также комфортный налоговый режим. «Китай с уровнем пиратства больше 90% показывает высокую динамику роста отрасли»,— пояснила госпожа Менькова.

Вице-президент ассоциации «Русский щит» Олег Яшин считает, что уровень пиратства в России не снижается, а растет. «Вероятно, BSA не учитывает пиратство в интернете, которое активно развивается на фоне снижения числа уличных ларьков с нелицензионным софтом. BSA не раскрывает методику исследования, поэтому их отчет можно трактовать не иначе как взгляд на проблему пиратства в России»,— говорит господин Яшин. По его словам, развитие широкополосного доступа в сеть только увеличит уровень пиратства в стране. «Где-то в конце 2007 года у людей, размещающих нелицензионный софт в сети, появилась возможность зарабатывать. За скачивания файлов им платят сайты, предназначенные для обмена файлами. Это сильно подстегнуло уровень пиратства»,— говорит Олег Яшин.

Александр Ъ-Малахов

Все новостройки от «БСА» отзывы о компании «БСА»

Компания «БСА»

ООО компания «БСА» хорошо известна на столичном рынке недвижимости. Это профессиональные риелторы, которые осуществляют свою деятельность на территории Москвы и области. За 10 лет работы они реализовали тысячи квадратных метров жилья, обеспечив жителей столицы и региона качественным жильем и коммерческими объектами.

Виды деятельности компании

Компания «БСА» оказывает услуги в сере реализации недвижимости. У них можно приобрести новостройки и объекты вторичного рынка. Кроме этого, идет работа в таких направлениях:

инвестиция в новые проекты;
осуществление заказов на строительство;
организация купли-продажи объектов недвижимости;
оказание профессиональной помощи в оформлении прав собственности;
разработка дизайн — проектов;
проведение ремонтно-отделочных работ;
содействие в ипотечном кредитовании.

«БСА» сотрудничает со многими строительными компаниями. Если вас интересует конкретный застройщик, официальный сайт компании содержит полную информацию о своих партнерах и их объектах.

Квартиры первичного рынка от компании «БСА»

ООО «БСА» реализует объекты первичного рынка и предлагает своим клиентам новостройки от застройщика. Это объекты малой и большой этажности, где каждый может подобрать для себя подходящее жилье.

У компании можно приобрести квартиры в новостройках от застройщика, которые отличаются нестандартной планировкой. Все они отличаются большой площадью остекления, что делает апартаменты максимально светлыми и просторными. В некоторых случаях высота потолка доходит до 3,9 метра. Это может быть как жилье с привычным для потребителя количеством комнат, так и квартиры-студии.

Риелтор готов предложить купить новостройку от застройщика, специализирующегося на возведении доступного жилья. Это ЖК с большой этажностью, с 1 и 2 комнатными просторными апартаментами, а также квартирами — студиями.

Особенности предложений компании

ООО «БСА» реализует различные новостройки Москвы и области от застройщика. Каждый жилой комплекс – это своеобразный город в городе, где есть собственная инфраструктура. Проектами предусмотрено создание максимально комфортных условий для жильцов. ЖК имеют собственные школы, детские сады, аптеки, магазины и другие объекты социальной и бытовой инфраструктуры.

Будущим собственникам жилья наверняка придутся по вкусу благоустроенные придомовые территории. Для самых маленьких приготовлены удобные игровые площадки с песочницами и качелями. Найдется место и для тех, кто не представляет свою жизнь без спорта. На специальных площадках есть все необходимое, чтобы поддерживать свое тело в тонусе. Во дворах есть места для прогулок и зоны отдыха.

Особое внимание уделяется озеленению. Аккуратные газоны и клумбы радуют глаз обитателей новостроек и их гостей. Осуществляется высадка деревьев и кустарников.

Как купить квартиру в новостройке?

Продажа новостроек от застройщика осуществляется различными способами. Покупатель имеет возможность выплатить полную стоимость жилья или воспользоваться ипотекой.

Компания оказывает содействие в заключение ипотечных договоров, и готова предложить заемщикам сотрудничество с различными банками. Это дает возможность выбрать финансовое учреждение, готовое предложить комфортные условия кредитования. Сроки кредитования могут быть различными.

Специалисты ООО «БСА» способны предоставить квалифицированную консультацию, разъяснив все особенности оформления кредита.

Вернуться выше чтобы продолжить чтение

Каминная топка Dovre 2400 BSA

Чугунная топка Dovre 2400 BSA – залог тепла в вашем доме

Если говорить о качестве каминного оборудования, продукция бренда Dovre считается одной из самых лучших в мире. Изготавливаемые в Норвегии чугунные топки соответствуют наивысшим стандартам безопасности и прекрасно себя показывают в процессе многолетней эксплуатации. Модель Dovre 2400 BSA — это высокотехнологичная топка для камина, изготавливаются из высококачественного чугуна и оснащены системой двойного горения и специальной системой очистки воздухом. возможно горизонтальное или вертикальное соединение. Регулируемые ножки позволяют установить нужную высоту.

Эксплуатационные характеристики оборудования Dovre 2400 BSA

Данная каминная топка отлично подойдет для тех домов, которые ограничены в пространстве. Она имеет компактные размеры, что позволяет вписать устройство в проем, нишу или расположить его возле стены. Также оборудование оснащено регулируемыми по высоте ножками, что дает возможность выбрать комфортное для себя положение. Топка Dovre 2400 BSA изготовлена из высокопрочного чугуна, который хорошо нагревается и отдает тепло. Также оборудование имеет такие характеристики:

классические дверцы с панорамным стеклом. Открываются они с правой стороны;
система двойного сжигания;
верхний обдув стекла, который защищает от задымления;
шамотные вставки для аккумулирования тепла;
отдельный зольный ящик;
система “холодной ручки”.

Важно, что оснащение устройства продумано таким образом, чтобы максимально упростить процесс эксплуатации и исключить риск получения травм.

Бычий сывороточный альбумин — обзор

BSA и cBSA

BSA (молекулярная масса 67 000) и катионизированный BSA (cBSA) представляют собой хорошо растворимые белки, содержащие многочисленные функциональные группы, подходящие для конъюгации. Эти носители обычно сохраняют растворимость даже после обширной модификации молекулами гаптена. Исключением из этого утверждения является конъюгирование гидрофобных пептидов или других труднорастворимых молекул с белками. Модификация любого носителя многочисленными гидрофобными гаптенами может вызвать достаточную маскировку гидрофильной поверхности, что приведет к осаждению.В зависимости от степени преципитации такие конъюгаты часто по-прежнему могут использоваться для создания иммунного ответа. Однако для ограничения образования нерастворимых комплексов реакцию конъюгации можно уменьшить, чтобы снизить уровень модификации носителя и, таким образом, уменьшить или исключить осаждение.

BSA содержит в общей сложности 59 лизиновых ε-аминовых групп (только 30–35 из них обычно доступны для дериватизации), один свободный цистеинсульфгидрил (с дополнительными 17 дисульфидами, скрытыми в его трехмерной структуре), 19 остатков фенолята тирозина и 17 гистидинимидазольных групп.Кроме того, наличие множества карбоксилатных групп придает БСА чистый отрицательный заряд (pI 5,1).

Катионизированный БСА получают путем модификации его карбоксилатных групп этилендиамином (Глава 2, Раздел 4.3) (Рисунок 19.2). Контролируемое аминоэтилирование с использованием водорастворимого карбодиимида EDC приводит к блокированию многих боковых цепей аспарагиновой и глутаминовой кислоты BSA (и, возможно, C-концевого карбоксилата), образуя амидную связь с 2-углеродным спейсером, содержащим концевую первичную аминогруппу.Поскольку вклады отрицательного заряда нативных карбоксилатов маскируются и вместо них образуются положительно заряженные амины, результатом этого процесса является значительное повышение pI белка. Катионизация, выполняемая в соответствии с опубликованными процедурами, изменяет чистый заряд BSA с pI около 5,1 (Cohn et al. , 1947) до более чем pI 11,0 (Muckerheide et al. , 1987).

Рисунок 19.2. Катионизированный бычий сывороточный альбумин (cBSA) образуется в результате реакции этилендиамина с нативным BSA с использованием водорастворимого карбодиимида EDC.Блокирование карбоксилатных групп белка в сочетании с добавлением концевых первичных аминов повышает pI молекулы до очень основных значений.

Высокоположительный заряд cBSA резко увеличивает его иммуногенность. Положительный характер молекулы способствует ее связыванию с антигенпрезентирующими клетками (APC) in vivo , что является первым шагом в производстве антител. Таким образом, белок включается в APC быстрее, чем молекулы с более низкими значениями pI. Он также обрабатывается с ускоренной скоростью, вызывая более быстрый иммунный ответ, который возникает при более высоких концентрациях специфических антител (Domen et al., 1987 г .; Muckerheide et al. , 1987b; Apple и др. , 1988 г .; Домен и Хермансон, 1992; Чен и др. , 2002).

Катионизированный БСА, используемый в качестве белка-носителя, также вызывает аналогичное увеличение продукции антител против любых прикрепленных молекул гаптена. Даже когда гаптены связаны через аминовые остатки cBSA, общий заряд молекулы остается достаточно основным, чтобы усилить иммунный ответ сверх того, который обычно достигается при использовании других носителей.Это увеличение происходит даже тогда, когда присоединенная молекула является не просто гаптеном, а более крупной макромолекулой антигена. Конъюгация полного антигена (молекулы, способной самостоятельно генерировать иммунный ответ) с cBSA вызывает усиленный иммунный ответ против антигена сверх того, который обычно достигается для нативного антигена, вводимого в неконъюгированной форме (Domen and Hermanson, 1992). Биоконъюгаты cBSA были разработаны для гликоконъюгатных вакцин на основе полисахаридов (Burtnick et al., 2012), для стратегий вакцин для преодоления атеросклероза (de Jager and Kuiper, 2011) и для создания катионных наночастиц cBSA для лечения болезни Паркинсона (Rodríguez et al. , 2011).

Эффективность cBSA в качестве носителя для пептидов исследовали с использованием аргининвазопрессина (AV) в качестве гаптена. На рисунке 19.3 показана концентрация антител, полученная после внутрибрюшинной (внутрибрюшинной) инъекции конъюгата AV-cBSA самкам мышей BDF ₁.В качестве контроля нативный BSA аналогично конъюгировали с AV и вводили второй группе мышей в идентичных условиях. Концентрации антител в сыворотках периодически контролировали с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). Антительный ответ, полученный в результате введения группы мышей неконъюгированного пептида, вычитали во всех случаях. Все инъекции выполняли с использованием 100 мкг конъюгата, смешанного с равным объемом квасцов (22,5 мг / мл гидроксида алюминия) в качестве адъюванта.

Рисунок 19.3. Эффективность конъюгата катионизированного носителя, используемого в качестве иммуногена, можно увидеть путем сравнения специфического ответа антител у мышей на аргинин вазопрессин (AV), связанный как с нативным BSA (nBSA), так и с катионизированным BSA (cBSA). Вводимое количество было стандартизировано в соответствии с количеством присутствующего аргинин-вазопрессина (АВ). Катионизированный носитель приводит к более высоким концентрациям антитела, продуцируемого против пептида, чем иммуноген, полученный с нативным nBSA.

После иммунизации группа мышей, получавших конъюгат AV-cBSA, генерировала более чем вдвое больший антительный ответ, чем группа, получавшая пептид, конъюгированный с нативным BSA.

В аналогичном исследовании OVA, конъюгированный с cBSA, сравнивали с тем же белком, конъюгированным с нативным BSA (nBSA), а также OVA, вводимым мышам в неконъюгированной форме. На рис. 19.4 показано, что до и после иммунизации конъюгат OVA-cBSA приводил к гораздо более высоким концентрациям антител, чем конъюгат OVA-nBSA или OVA, введенный в неконъюгированной форме. Аналогичные результаты были получены для конъюгата человеческого IgG с cBSA (рис. 19.5).

Рисунок 19.4. Катионизированный cBSA может даже увеличивать специфический ответ антител на большие белки, связанные с ним.На этом графике показано сравнение относительного ответа антител у мышей на инъекции овальбумина (OVA) либо в неконъюгированной форме, либо в конъюгированном с nBSA (нативным) или катионизированном (cBSA). Вводимое количество было стандартизировано в соответствии с количеством присутствующего овальбумина OVA. Высокоосновная молекула cBSA модулирует иммунный ответ, увеличивая выработку антител даже против полноразмерных белков, конъюгированных с ней.

Рисунок 19.5. Человеческий IgG вводили мышам либо в неконъюгированной форме, либо в поперечно сшитой cBSA.Вводимое количество было стандартизировано в соответствии с количеством присутствующего IgG. Более высокий антительный ответ был получен при использовании конъюгата cBSA.

Следствием использования cBSA в качестве белка-носителя является то, что его повышенный иммунный ответ часто исключает использование полного адъюванта Фрейнда, что является источником беспокойства из-за его потенциальных побочных эффектов у животных. Относительно безвредная смесь с квасцами обычно является всем, что требуется в качестве адъюванта для получения хорошего продуцирования антител.

Как упоминалось ранее для KLH, ДМСО можно использовать для солюбилизации молекул гаптена, которые довольно нерастворимы в водной среде. Реакции конъюгирования могут проводиться в смесях растворитель / водная фаза для поддержания некоторой растворимости гаптена после его добавления в буферный раствор. БСА остается растворимым в присутствии до 35% ДМСО, становится слегка мутным при 40% и осаждается при 45% (об. / Об.).

Большой день дарения

ИНВЕСТИРУЙТЕ в Скаутинг!

В этот последний год беспорядков легко отвлечься от БОЛЬШОЙ картины.В частности — сосредоточение внимания на нашем будущем и на том, что мы можем с ним сделать. Самая важная часть нашего будущего — это построение нашей молодежи.

Скаутинг — один из лучших способов для молодежи обрести ценности, которые формируют сильный индивидуальный характер, укрепляют семьи и поддерживают мирные сообщества.

Наша программа лидерства бойскаутов, основанная на ценностях, важна как никогда. Пожалуйста, подумайте об инвестициях в нашу скаутскую молодежь.

Скауты всех возрастов продолжают жить согласно Скаутской Клятве и Закону, чтобы « всегда помогать другим людям » и « Будьте готовы .”

Даже с волнением 2020 года — мы расширили наши программы, включив в них виртуальные мероприятия, такие как: Day Camp in a Box, Camp It Out и Merit Badge Madness. Все эти модули онлайн и доступны в настоящее время. Многие Cub Scout, Scouts BSA и Venture Units проводят собрания Zoom и наслаждаются небольшими мероприятиями, где это разрешено. Все это соответствует государственным и местным нормам безопасности для собраний. Самое главное — наши девичьи войска растут! У нас даже есть первая группа девочек-скаутов-орланов, которые получают свои награды.

Ваш подарок поможет разведке « Будьте готовы », когда мы пройдем через COVID и сможем начать предлагать наши программы на открытом воздухе. Все пожертвования остаются здесь, в районе Северной Калифорнии, и будут использоваться для обеспечения безопасности наших программ, лагерей и молодежи. Вы нужны скаутингу сейчас — больше, чем когда-либо.

Спасибо за ваше сердечное внимание и неизменную поддержку Совета Золотой Империи, бойскаутов Америки!

Кому ИНВЕСТИРОВАТЬ в разведку в Совете Золотой Империи щелкните: [Пожертвовать сейчас]
-или- Загрузите здесь, чтобы завершить оффлайн, или с помощью текста: bit.ly / GECBSAGiveTues2020

Совет Южной Флориды, Бойскауты Америки

ВЕЛИКАЯ ИНВЕСТИЦИЯ

Чтобы выполнить миссию Скаутинга, нам нужны ресурсы. Щедрая поддержка нашего сообщества позволяет нам воплотить в жизнь магию Скаутинга. Вот где вы входите! Хотите ли вы пожертвовать свое время, талант или сокровища, вы окажете огромное влияние на молодежь.У нас есть множество отличных вариантов на выбор.

Напоминаем, что Закон 2020 CARES разрешает налоговый кредит в размере 300 долларов «сверх нормы»; 600 долларов для подателей швов! Пожалуйста, проконсультируйтесь со своим налоговым консультантом за дополнительными советами.

ПОЖЕРТВОВАТЬ СЕЙЧАС

(Мы используем Network for Good для обработки онлайн-пожертвований)

КТО ПЛАТИТ ЗА РАЗВЕДКУ? — Это методика всех уровней, бизнес-план!

Кто платит за разведку — аналогия с айсбергом

Самая последняя проаудированная финансовая отчетность — Аудит SFCBSA 2019

Последние 990 IRS — Совет Южной Флориды по благотворительному навигатору или Совет Южной Флориды на Guidestar

Политика конфиденциальности доноров

Федеральный налоговый идентификационный номер —

TIN / EIN предназначен для использования Советом Южной Флориды, Inc., Бойскауты Америки (SFC). Статус освобождения от налогов любой стаи, отряда, команды или почты связан с их зафрахтованной или участвующей организацией. Федеральный налоговый идентификационный номер не может использоваться Скаутской группой; только Совет Южной Флориды, Inc. Он не может использоваться для открытия банковских счетов или любого другого использования, кроме как SFC.

Штат Флорида — Закон о привлечении взносов —

КОПИЯ ОФИЦИАЛЬНОЙ РЕГИСТРАЦИИ И ФИНАНСОВОЙ ИНФОРМАЦИИ МОЖЕТ БЫТЬ ПОЛУЧЕНА В ОТДЕЛЕНИИ ПОТРЕБИТЕЛЬСКИХ УСЛУГ, БЕСПЛАТНО ЗВОНИТЕ В ГОСУДАРСТВЕ.(Ch2340) РЕГИСТРАЦИЯ НЕ ПОДРАЗУМЕВАЕТ ОДОБРЕНИЯ, УТВЕРЖДЕНИЯ ИЛИ РЕКОМЕНДАЦИИ ГОСУДАРСТВА. Бесплатный номер FDACS: 1-800-HELP-FLA (435-7352).

Florida Check a Charity — НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ

способов дарить — Los Padres Council BSA

Завещания и завещания
Завещание — один из самых простых подарков. С помощью консультанта вы просто включаете формулировку в свое завещание или траст, определяя подарок, который будет сделан бойскаутам Америки как часть вашего имущественного плана.Вы можете установить свое наследие, и оно остается отзывным в любое время в течение вашей жизни. Для жертвователей с облагаемым налогом имуществом благотворительные завещания при распределении полностью не облагаются налогом. Вы можете рассмотреть множество видов наследства. Мы рекомендуем вам посетить своего консультанта по поводу запланированных пожертвований. Нажмите здесь, чтобы увидеть ОБРАЗЕЦ УСЛОВИЙ ЗАКАЗА.

Простое изменение воли
Если у вас уже есть завещание и вы хотите внести некоторые простые изменения, вы можете сделать это с помощью кодицила.Кодицил — это простое дополнение или поправка к существующему завещанию. Как и в случае с завещаниями, кодицилы включают определенные формальности для подписания и могут быть отозваны или изменены в течение вашей жизни. Но какими бы ни были ваши благотворительные планы, убедитесь, что у вас есть действующее завещание, и регулярно пересматривайте его, чтобы оно отвечало меняющимся потребностям вас и вашей семьи. Щелкните здесь, чтобы получить ОБРАЗЕЦ КОДИЦИЛА.

IRA и пенсионные планы
Активы пенсионного фонда могут быть одним из наиболее значительных активов, оставшихся в собственности.К сожалению, подарок ИРА ребенку или внуку — или кому-либо, кроме супруга или благотворительной организации — может быть одним из самых дорогих подарков. Пенсионные фонды, выделяемые детям или внукам, могут облагаться двойным налогом или, что еще хуже, оставлять лишь небольшую часть для ваших предполагаемых бенефициаров. Многие жертвователи считают, что пожертвование активов IRA на благотворительность является эффективным и разумным с точки зрения налогообложения способом пожертвования. Назначить местный совет альтернативным или условным бенефициаром пенсионных счетов так же просто, как запросить форму смены бенефициара у администратора вашего плана.

Страхование жизни
Есть ли у вас страховые полисы, которые больше не нужны по их первоначальному назначению? У вас есть политика…?

предоставление денег супругу или детям, которым они больше не нужны?
, покрывающий ипотеку дома или другой собственности, которая уже погашена?
покрывает расходы на образование, которых больше нет?
защищает бизнес, которым вы больше не владеете или который на данный момент имеет другое покрытие?

Пожертвуйте новый или существующий полис компании Scouting, и ваш налоговый вычет будет примерно равен возвращаемой стоимости полиса.Может быть полезно пожертвовать такие полисы и получить налоговый вычет. Как правило, вы также можете вычесть любые годовые суммы, уплаченные для сохранения действия политики.

Фонд, рекомендованный донором
Фонд, рекомендованный донором, подобен счету для благотворительных инвестиций, с единственной целью — поддерживать благотворительные организации, которые вам небезразличны. Когда вы вносите денежные средства, ценные бумаги или другие активы в фонд, рекомендованный донорами, в некоммерческую организацию по вашему выбору (Los Padres Council) или в общественную благотворительную организацию, такую как Fidelity Charitable, вы обычно имеете право на немедленный налоговый вычет.Затем эти средства можно инвестировать для роста, не облагаемого налогом, и вы можете порекомендовать, как распределять средства в муниципалитете Лос-Падрес.

Когда вы даете, вы хотите, чтобы ваши благотворительные пожертвования были максимально эффективными. Фонды, рекомендованные донорами, являются наиболее быстрорастущим средством благотворительности в Соединенных Штатах, потому что они являются одним из самых простых и наиболее выгодных с точки зрения налогообложения способов раздачи благотворительности.

Благотворительные трасты
Эти трасты могут регулярно распределять доход между донором, семьей или BSA, и их условия очень гибкие.Когда траст заканчивается, средства могут быть переданы Скаутингу или дарителю и семье, в зависимости от желания дарителя.

Благотворительный траст на остаток (CRT)
Благотворительный траст на остаток обеспечивает жертвователя или других лиц денежным потоком при получении вычета по подоходному налогу с физических лиц за текущий год. Донор вносит активы в траст, который ежегодно осуществляет выплаты дарителю (или другим лицам) в течение указанного количества лет (или в течение жизни бенефициара). По истечении этого периода все активы, оставшиеся в трасте, переходят в одну или несколько благотворительных организаций, выбранных жертвователем

Charitable Lead Trusts (CLT)
Этот вариант поможет вам избежать тяжелого бремени, связанного с налогами на дарение и наследство, возникающими при прямой передаче собственности членам семьи.В отличие от других вариантов траста, ведущий траст с самого начала выплачивает доход Los Padres Council в течение определенного срока, а принципал в конечном итоге возвращается обратно донору или другим не благотворительным бенефициарам. При определенных условиях ведущий траст немедленно производит вычет подоходного налога.

Некоторые думают о свинцовом трасте как о партнерстве между собой и благотворительной организацией. Некоторые видят в этом «зеркальное отражение» благотворительного фонда остатка. Для других это ссуда на благотворительность.Но большинство людей согласны с тем, что лид-траст — отличный способ сделать значительный подарок Скаутингу, используя средства, которые в конечном итоге вернутся вам или вашим близким. Это также отличный способ передать активы своим близким по очень небольшой цене.

Аннуитет в виде благотворительных пожертвований
Поддерживает муниципалитет Лос-Падрес. В прямом смысле. С помощью приведенных ниже вариантов подарков, приносящих доход, вы можете создать дополнительный источник дохода или увеличить свои пенсионные активы, пользуясь при этом основными налоговыми льготами.Аннуитет в виде благотворительного подарка — это простой договор между дарителем и BSA. В обмен на подарок BSA соглашается производить выплаты дарителю или другим лицам, выбранным дарителем. Эти выплаты производятся пожизненно одному или двум лицам и гарантируются общими активами бойскаутов Америки. Жертвователь также получает благотворительный вычет по подоходному налогу. Подарок может быть наличными, акциями, облигациями или акциями паевого инвестиционного фонда.

В конце срока аннуитета подарка (срока жизни получателя (ов) платежа, оставшаяся стоимость первоначального подарка удаляется из фонда аннуитета подарка и передается совету, выбранному дарителем.Аннуитеты на благотворительные пожертвования обрабатываются в рамках Программы аннуитетных пожертвований в Национальном центре обслуживания BSA; это освобождает наш совет от административного бремени, подачи государственных документов и сборов.

Free Estate Planning Guide
Готовы ли вы спланировать свою волю или доверие? Если вы планируете поделиться идеями или задать вопросы, звоните в Los Padres Council по телефону 805-967-0105. Кроме того, мы хотели бы дать вам БЕСПЛАТНОЕ руководство по планированию недвижимости. Эта полезная информация может помочь вам успешно спланировать свое поместье.Мы также рекомендуем вам посетить своего консультанта по поводу запланированных пожертвований. Бесплатное руководство по планированию недвижимости можно получить в Интернете, щелкнув здесь.

Кинетика термической денатурации и агрегации бычьего сывороточного альбумина

Abstract

Термическая агрегация бычьего сывороточного альбумина (БСА) была изучена с использованием динамического светорассеяния, асимметричного полевого фракционирования потока и аналитического ультрацентрифугирования. Исследования проводились при фиксированных температурах (60 ° C, 65 ° C, 70 ° C и 80 ° C) в 0.1 М фосфатный буфер, pH 7,0, при концентрации BSA 1 мг / мл. Термическую денатурацию белка изучали методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Анализ экспериментальных данных показывает, что при 65 ° C стадия разворачивания белка и отдельные стадии агрегации белка заметно разделены во времени. Это обстоятельство позволило нам предложить следующий механизм термической агрегации БСА. Разворачивание белка приводит к образованию двух форм ненативного белка с разной склонностью к агрегации.Одна из форм (высокореактивная развернутая форма, U _час) характеризуется высокой скоростью агрегации. Агрегация U _hr приводит к образованию первичных агрегатов с гидродинамическим радиусом ( R _{h, 1}) 10,3 нм. Вторая форма (низкореактивная развернутая форма, U _lr) участвует в процессе агрегации путем присоединения к первичным агрегатам, продуцируемым формой U _hr, и обладает способностью к самоагрегации с образованием устойчивых агрегатов небольшого размера ( А _st).При полном исчерпании U _lr образуются вторичные агрегаты с гидродинамическим радиусом ( R _{h, 2}) 12,8 нм. При 60 ° C скорости развертывания и агрегации соизмеримы, при 70 ° C скорости образования первичных и вторичных агрегатов соизмеримы, при 80 ° C регистрация начальных стадий агрегации затруднена образованием крупноразмерных агрегатов. агрегаты.

Введение

Стабильность большинства белков зависит от определенных условий, включая температуру, pH и ионную силу.Нативные белки могут разворачиваться в присутствии денатурирующих агентов, а также в результате воздействия высоких температур. Развернутые белки могут взаимодействовать посредством экспонированных гидрофобных последовательностей с образованием аморфных или амилоидных агрегатов [1–6].

Термическая агрегация белков включает стадию разворачивания белка, за которой следует агрегация развернутых молекул белка. Кинетический режим общего процесса термической агрегации белков определяется соотношением скоростей стадий разворачивания и агрегации.Если скорость стадии агрегации значительно выше скорости стадии разворачивания, лимитирующей стадией общего процесса агрегации будет стадия разворачивания белка. Чтобы доказать выполнение этого кинетического режима для глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) из скелетных мышц кролика, мы исследовали агрегацию этого белка в условиях, когда температура повышалась с постоянной скоростью [7]. Агрегацию регистрировали путем измерения приращения интенсивности светорассеяния.Денатурацию GAPDH контролировали с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Линейный характер зависимости интенсивности светорассеяния от доли денатурированного белка был интерпретирован как свидетельство выполнения кинетического режима, в котором денатурация белка является лимитирующей стадией.

Для получения более обоснованной информации о кинетическом режиме термической агрегации белков эксперименты следует проводить следующим образом. Прежде всего, необходимо использовать прямые методы определения концентрации агрегированного белка.Дальнейшее сравнение долей денатурированного и агрегационного белка позволяет сделать вывод о природе лимитирующей стадии. В настоящей работе мы использовали этот подход для изучения кинетики термической агрегации бычьего сывороточного альбумина (БСА).

BSA, водорастворимый мономерный белок с молекулярной массой 66,4 кДа [8], состоит из трех гомологичных доменов, образованных шестью α-спиралями [9]. Полипептидная цепь БСА, состоящая из 583 аминокислотных остатков [10], содержит всего два остатка триптофана [11,12].Два триптофана в молекуле БСА встроены в два разных домена: Trp-134, расположенный вблизи поверхности белка, но скрытый в гидрофобном кармане домена I, и Trp-214, расположенный во внутренней части домена II [12]. .

BSA имеет 17 внутрицепочечных дисульфидных мостиков и одну сульфгидрильную группу (Cys-34) [8,13]. Дисульфидные связи придают некоторую жесткость каждому субдомену, но допускают значительные модификации формы и размера белка при различных внешних условиях [8,13,14].При нейтральном pH дисульфидные мостики скрыты в молекуле белка и не подвергаются действию растворителя [15]. Уникальный свободный цистеин (Cys-34) расположен в домене I в гидрофобном кармане молекулы БСА [16].

BSA подвергается обратимой конформационной изомеризации в зависимости от pH, превращаясь из компактной формы N (при нейтральном pH) в менее компактную форму F (например, при pH 4) [16,17]. При нагревании компактная нативная форма БСА становится более гибкой и реакционной [18,19], а остатки Tyr и Trp подвергаются воздействию более полярного окружения [20].Термическое поведение BSA зависит от pH инкубационной среды. На основе экспериментов ДСК было показано, что при значениях pH 6,0–8,5 процесс денатурации БСА представляет собой сумму двух независимых одноступенчатых переходов [21,22]. Сообщалось, что при pH 7 N-концевой домен I молекулы BSA разворачивается, а домены II и III плавятся вместе при более высоких температурах [23]. Такое поведение БСА при нагревании определяется многодоменной структурой БСА [24].

Разворачивание БСА, вызванное нагреванием водных растворов белка, вызывает его агрегацию [19,25–27].Скорость агрегации БСА при нагревании зависит от температуры, значений pH, концентрации белка, времени инкубации и концентрации соли [28]. Все эти факторы влияют на размер агрегатов. Согласно данным динамического рассеяния света (DLS), повышение температуры с 30 ° C до 60 ° C при pH 7,0 привело к небольшому увеличению гидродинамического радиуса ( R _h) молекул BSA [20,29] . Однако при нагревании выше 65 ° C в течение 10 минут наблюдалось экспоненциальное увеличение R _h, что свидетельствует о возникновении агрегации БСА.Быстрый рост гидродинамического радиуса агрегатов БСА на ранних стадиях (в течение первых 30 мин) сменялся незначительным увеличением на временном интервале 30–180 мин. Изучение агрегации БСА, индуцированной нагреванием, с помощью асимметричного полевого фракционирования потока (AF4) также позволило показать, что гидродинамический диаметр агрегатов БСА зависит от концентрации белка, продолжительности инкубации и ионной силы растворителя [30].

Имеющиеся данные указывают на то, что механизм индуцированной нагреванием агрегации БСА происходит двумя разными путями: образование относительно небольших «растворимых» агрегатов путем превращения α-спирали в β-агрегированные структуры в результате электростатических взаимодействий или образования агрегаты большего размера за счет гидрофобных взаимодействий [31,32].По данным Honda et al. [26], при относительно низких температурах и низких концентрациях БСА наблюдаются два процесса термической агрегации. Первый протекает по механизму межмономерной агрегации, а второй — по механизму межагрегатной агрегации. В первом процессе мономеры BSA агрегируются, размер их частиц увеличивается, и почти все мономеры сливаются в агрегат. Первый процесс протекает в режиме кластерно-кластерной агрегации с ограниченной диффузией (DLCA). Во втором процессе происходит взаимодействие агрегатов, и размер частиц быстро увеличивается.Когда размер частиц достигает плато, частицы больше не агрегируют, потому что концентрация оставшегося мономерного БСА слишком мала для дальнейшей агрегации. Размер частиц в этой области плато зависит от температуры.

В недавней работе Sahin et al. [33] Термическую агрегацию BSA изучали с помощью SEC-HPLC в интервале температур от 50 ° C до 70 ° C. Результаты показали, что BSA необратимо агрегировал как за счет последовательного добавления мономера, так и за счет агрегатно-агрегатных взаимодействий.Агрегат-агрегатные взаимодействия были значительными при температуре выше 63–65 ° C, особенно на более поздних стадиях агрегации, когда казалось, что последовательное добавление мономеров прекращается.

Holm et al. [34] показали, что амилоидные агрегаты БСА образовывались через несколько минут после начала инкубации белка при нейтральном pH и повышенных температурах. Реакция протекала без лаг-фазы и не ускорялась посевом. Агрегаты амилоида могут быть цитотоксичными или в некоторых случаях могут быть функциональными и полезными для здоровья.Амилоидные агрегаты БСА нецитотоксичны [34], не вызывают амилоидных заболеваний и могут иметь какое-то практическое применение.

Анализ литературных данных о термической агрегации БСА показывает, что для построения полной картины путей агрегации БСА необходимо провести дополнительные кинетические исследования с привлечением различных физических и физико-химических методов. Особое внимание следует уделять сравнению частей денатурированного и агрегированного белка и возможности изменения лимитирующей стадии стадии общего процесса агрегации при изменении температуры эксперимента по агрегации.

Коммерческие препараты BSA легко доступны. Поэтому БСА является подходящим объектом для создания тест-систем, предназначенных для скрининга агентов, обладающих антиагрегационной активностью. Shah et al. [35] использовали тест-систему, основанную на термической агрегации БСА, для исследования антиагрегационной активности аргинина. Ряд работ посвящен использованию тест-системы на основе дитиотреитол-индуцированной агрегации БСА для тестирования шапероноподобной активности шаперонов белковой природы и химических шаперонов [36–38].Для выяснения механизма антиагрегационной активности шаперонов и количественной оценки их защитной эффективности необходимо исследование механизма агрегации белковых субстратов.

В данной работе мы исследовали кинетику термической агрегации БСА в интервале температур от 60 ° C до 80 ° C с использованием DLS и AF4. Для контроля разворачивания BSA использовали DSC. Морфологию агрегатов БСА изучали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Взаимосвязь между неагрегированными и агрегированными формами в препарате BSA, предварительно инкубированном при 60 ° C, также была охарактеризована с помощью аналитического ультрацентрифугирования (AUC).Для выделения фракции неагрегированной развернутой формы BSA применялась эксклюзионная хроматография (SEC). На основе анализа взаимосвязи между частью агрегированного белка (γ _agg) и частью денатурированного белка и взаимосвязи между интенсивностью светорассеяния и γ _agg была разработана модель термической агрегации БСА. . Модель предполагает образование первичных агрегатов с участием высокореактивной развернутой формы БСА, рост первичных агрегатов в результате присоединения низкореактивной развернутой формы БСА и дальнейшее слипание новообразованных вторичных агрегатов с образованием полидисперсных аморфные агрегаты.

Материалы и методы

Материалы

BSA (обедненный жирными кислотами, каталожный номер A7638, 99+% чистоты), одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия и хлорид натрия были приобретены у Sigma-Aldrich и использовались без дополнительной очистки. Флуоресцентные пробы тиофлавин Т (ThT) и 8-анилинонафталин-1-сульфоновая кислота (ANS) были получены от Sigma-Aldrich. Все растворы для экспериментов готовили на деионизованной воде, полученной с помощью системы Easy-Pure II RF (Barnstead, США).Образцы БСА получали растворением твердого БСА в 0,1 М фосфатных буферных растворах при pH 7,0. Все эксперименты проводились со свежеприготовленными растворами БСА. Концентрацию БСА определяли спектрофотометрически при 280 нм, используя коэффициент поглощения Acm1%, равный 6,58 [39].

Эксклюзионная хроматография

Образцы белка загружали в колонку (Sephacryl S100 HR) и разделяли на фракции при скорости потока 2,5 мл / мин (20 ° C). Колонка была предварительно откалибрована со следующими белками (Sigma-Aldrich): тиреоглобулин (660 кДа), каталаза (440 кДа), альдолаза (158 кДа), BSA (67 кДа), γ-кристаллин (20 кДа).Относительная погрешность определения массы белка составила 4%.

Калориметрические исследования

Температурную денатурацию БСА в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, pH 7,0, изучали методом ДСК на адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4М (Институт биологических инструментов РАН, Пущино, Россия) с капилляром 0,47 мл. платиновые элементы. Все измерения проводились со скоростью нагрева 1 ° C / мин в диапазоне температур от 42 ° C до 70 ° C и при постоянном давлении 2.2 атм. Зависимости тепловой мощности от температуры рассчитывали с помощью программы Origin (MicroCal, Inc., США). Капиллярная конструкция калориметрических ячеек предотвращает артефакты, вызванные осаждением белка, которые часто наблюдаются в калориметрических ячейках периодического действия в виде экзотермических пиков. Все измерения повторяли трижды для каждого образца.

Просвечивающая электронная микроскопия

Аликвоты BSA добавляли к предварительно нагретому 0,1 М Na-фосфатному буферу, pH 7,0, до конечной концентрации белка 1 мг / мл и инкубировали при 65 ° C в течение 110 или 330 мин.Образцы охлаждали до комнатной температуры и диализовали против деионизованной воды при 4–8 ° C в течение 16 ч. Аликвоты каждого диализованного образца разбавляли деионизированной водой в 100 раз.

Капли разбавленных и неразбавленных образцов BSA помещали на покрытые углеродом медные сетки. Для сравнения добавляли каплю раствора вируса табачной мозаики как объект с известным диаметром (15–18 нм). Излишки образцов удаляли с помощью куска фильтровальной бумаги. Сетки с неразбавленными образцами дополнительно промывали деионизированной водой.

Сетки окрашивали 2% (мас. / Об.) Фосфорновольфрамовой кислотой, pH 7,2 (избыток удаляли с помощью куска фильтровальной бумаги) и сушили на воздухе при комнатной температуре. Изображения были получены с помощью просвечивающего электронного микроскопа JEOL-JEM100-CX, работающего при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Спектроскопия кругового дихроизма

Спектры КД и спектры поглощения растворов БСА регистрировали на спектрометре Chirascan (Applied Photophysics, Великобритания) в интервале длин волн 185–320 нм, с 1.Ширина щели 5 нм и шаг 0,5 нм при 20 ° C. Концентрация белка во всех образцах составляла около 0,1 мг / мл (0,01 М Na-фосфатный буфер, pH 7,0). Длина оптического пути составляла 0,1 см. Точную концентрацию белка определяли с использованием коэффициентов экстинкции пептидной связи при 205, 210 и 215 нм [40]. Все измерения повторяли трижды для каждого образца.

Измерения флуоресценции

Спектры флуоресценции регистрировали на флуоресцентном спектрофотометре Cary Eclipse (Varian, Agilent Technologies, Inc., США). Образцы БСА (1 мг / мл) предварительно инкубировали в течение 12 ч при 60 ° C, 65 ° C, 70 ° C или 80 ° C. Интенсивность флуоресценции раствора ThT и ThT, инкубированных с предварительно нагретым BSA (0,4 мг / мл) в течение 1 ч при комнатной температуре, измеряли при возбуждении при 450 нм (ширина щели 5 нм). Интенсивность флуоресценции ANS (конечная концентрация 10 мкМ), инкубированного с BSA (0,1 мг / мл) в течение 1 ч при комнатной температуре, измеряли при возбуждении при 380 нм (ширина щели 5 нм).

Измерения дзета-потенциала

Дзета-потенциал BSA измеряли с помощью прибора Photocor Compact-Z (Photocor Instruments, Inc., США). В качестве источника света использовался лазер с длиной волны 654 нм. Измерения проводились при напряжении электрического поля 5 В / см и температуре 23 ° C в стеклянных цилиндрических пробирках с одноразовыми Au-электродами. Расстояние между электродами составляло 0,4 см. Рассеянный свет собирался под углом 20 °. Эксперимент повторяли трижды для каждого образца.

Измерения интенсивности светорассеяния

Для измерения светорассеяния коммерческий прибор Photocor Complex (Photocor Instruments, Inc., США). В качестве источника света использовался He-Ne лазер (Coherent, США, модель 31–2082, 632,8 нм, 10 мВт). Для полидисперсного анализа данных DLS использовали программу DynaLS (Alango, Израиль). Коэффициент диффузии D частиц напрямую связан со скоростью затухания τ _c зависящей от времени корреляционной функции для флуктуаций интенсивности светорассеяния:

В этом уравнении k — волновое число рассеянного света, k = (4π n / θ) sin (θ / 2), где n — показатель преломления растворителя, λ — длина волны падающего света в вакууме, θ — угол рассеяния.Средний гидродинамический радиус частиц R _h может быть рассчитан по уравнению Стокса-Эйнштейна:

где k _B — постоянная Больцмана, T — абсолютная температура, а η — динамическая вязкость растворителя.

Кинетику тепловой агрегации БСА изучали в 0,1 М Na-фосфатном буфере, pH 7,0. Буфер помещали в цилиндрическую кювету с внутренним диаметром 6.3 мм и предварительно инкубировали в течение 5 мин при заданной температуре.Ячейки с пробкой использовали во избежание испарения. Процесс агрегации инициировали добавлением аликвоты раствора BSA в предварительно нагретый буфер до конечного объема 0,5 мл. При изучении кинетики агрегации БСА рассеивающий свет собирали под углом рассеяния 90 °.

В случае ограниченной диффузией кластер-кластерной агрегации (DLCA) зависимость гидродинамического радиуса ( R _h) белковых агрегатов от времени подчиняется степенному закону [41,42]:

Rh = Rh * [1 + K (t − t *)] 1 / d f, (t> t *),

(3)

где t * — момент начала реализации кинетического режима, Rh * — гидродинамический радиус при t = t *, K — константа и d _f — фрактальный габариты агрегатов ( d _f = 1.8 для кинетического режима DLCA).

Асимметричное полевое фракционирование потока с помощью многоугольного светорассеяния (MALS) в режиме онлайн, детекторы ультрафиолетового (УФ) и показателя преломления (RI)

Система разделения Eclipse 3 (Wyatt Technology Corporation, США) на основе ВЭЖХ Agilent насос (Agilent Technologies, США) использовали для экспериментов с AF4. Образец БСА в 0,1 М Na-фосфатном буфере, pH 7,0, предварительно нагретый до 60 ° C, 65 ° C, 70 ° C и 80 ° C и охлажденный до комнатной температуры 23 ° C, вводили в канал разделения с помощью системы автоинжекции Agilent ( Agilent Technologies, США).Использовали канал диаметром 21,4 см с разделителем канала 350 мкм и ультрафильтрационной мембраной из регенерированной целлюлозы с отсечкой молекулярной массы 10 кДа (Wyatt Technology Corporation, США). Проточную систему последовательно соединяли с УФ-детектором (Agilent Technologies, США), детектором MALS (DAWN HELEOS II, Wyatt Technology Corporation, США) и детектором RI (Optilab T-rEX, Wyatt Technology Corporation, США). Элюирование проводили 0,1 М фосфатным буфером, pH 7,0. Данные с детекторов обрабатывались в программе ASTRA версии 5.3.4 (Wyatt Technology Corporation, США) для получения окончательных профилей. Эксперимент проводился при комнатной температуре (23 ° C).

Аналитическое ультрацентрифугирование

Эксперименты по скорости оседания проводили при 25 ° C в аналитической ультрацентрифуге модели E (Beckman), оснащенной оптикой поглощения, фотоэлектрическим сканером, монохроматором и компьютером, работающим в режиме онлайн. Использовались ротор из титана An-F с четырьмя отверстиями и двухсекторные ячейки диаметром 12 мм. Профили седиментации БСА (0,1 М Na-фосфатный буфер, pH 7.0, содержащий 10 мМ NaCl) регистрировали путем измерения оптической плотности при 285 нм. Все клетки одновременно сканировали против буфера, содержащего те же добавки. Временной интервал между сканированиями составлял 3 мин. Коэффициенты седиментации оценивались по дифференциальному распределению коэффициентов седиментации [ c ( s ) по сравнению с с ] или [ls-g * ( с ) по сравнению с с ], которые были проанализированы с помощью программы SEDFIT [43 , 44]. Анализ c ( s ) был выполнен с регуляризацией с уровнем достоверности 0.68 и плавающий коэффициент трения. Коэффициенты седиментации корректировали к стандартным условиям (растворитель с плотностью и вязкостью воды при 20 ° C) с помощью программ SEDFIT и SEDNTERP [45]. Средневзвешенные коэффициенты седиментации ( s _av) были получены интегрированием распределения c ( s ). Молекулярную массу интактного БСА рассчитывали из распределения c ( M ) с использованием программы SEDFIT.

Анализ данных

OriginPro 8.0 SR0 (OriginLab Corporation, США). Для характеристики степени соответствия экспериментальных данных расчетным значениям использовался коэффициент детерминации R ² [46].

Результаты и обсуждение

Кинетика термической денатурации BSA

ДСК использовали для мониторинга кинетики термической денатурации BSA в 0,1 М Na-фосфатном буфере, pH 7,0. показаны результаты исследования стабильности BSA с помощью DSC.Кривая 1 на этом рисунке соответствует профилю DSC для исходного препарата BSA. Положение максимума ( T _max) на зависимости избыточной теплоемкости от температуры составило 59,5 ± 0,1 ° C. Раствор БСА нагревали при 60 ° C в течение разных интервалов времени (0–90 мин). Предварительно нагретые растворы охлаждали до комнатной температуры и количество оставшегося нативного белка определяли с помощью DSC. Кривые 2–6 соответствуют профилям ДСК для предварительно нагретых образцов БСА. T _max значений для этих профилей DSC попадают в интервал от 58,8 ° C до 60,0 ° C (см. Вставленную таблицу) и, следовательно, близки к значению T _max для необработанного образца BSA. Предполагается, что теплота денатурации ( Q ), выраженная площадью под профилем ДСК, пропорциональна количеству нативного белка. В этом случае соотношение Q / Q ₀ ( Q ₀ — теплота денатурации для исходного препарата БСА) дает часть белка, остающуюся в нативном состоянии (γ _nat) в течение предварительный нагрев.

Профили ДСК для БСА (1 мг / мл), предварительно нагретого до 60 ° C (0,1 М Na-фосфатный буфер, pH 7,0).

Зависимости избыточной теплоемкости (ΔCpex) от температуры для БСА, предварительно инкубированного при 60 ° C, для различных интервалов времени ( t _inc): 1 — 0, 2 — 5, 3 — 15, ( 4) 30, (5) 60 и (6) 90 мин. Каждый профиль DSC представляет собой среднее значение трех измерений. Скорость нагрева составляла 1 ° С / мин. Во вставленной таблице указано значение T _max для предварительно нагретых препаратов BSA.

Зависимости γ _nat от времени, демонстрирующие кинетику необратимой денатурации БСА при 60 ° C, 65 ° C, 70 ° C и 80 ° C, представлены в. Эти зависимости аппроксимировались эмпирическим уравнением, содержащим два показателя степени:

γnat = B⋅exp (−k1, dent) + (1 — B) ⋅exp (−k2, dent),

(4)

где B — амплитуда экспоненциального члена, соответствующего константе скорости k _{1, den}. Рядом с кривыми на рис.Уравнение 4 можно использовать для вычисления интерполированных значений γ _nat в разное время.

Кинетика термической денатурации BSA при (A) 60 ° C, (B) 65 ° C, (C) 70 ° C и (D) 80 ° C.

Зависимости доли нативного белка (γ _nat) от времени. Значение γ _nat было рассчитано как отношение Q / Q ₀ ( Q ₀ и Q — теплоты денатурации, определенные по площади под профилями ДСК).Сплошные кривые рассчитаны по уравнению 4, содержащему параметры B , k _{1, den} и k _{2, den}.

Для сравнения термостабильности BSA при различных температурах можно использовать параметр t0.5den (время полупревращения). При повышении температуры от 60 ° C до 80 ° C наблюдалось 13-кратное уменьшение значения t0,5den ().

Таблица 1

Параметры термической денатурации и агрегации бычьего сывороточного альбумина ([BSA] = 1 мг / мл, 0.1 М Na-фосфатный буфер, pH 7,0).

γ _Uhr + γ _{Ulr, agg} = 0.49 ± 0,01 0,01

T , ° C	t0.5den, мин	γ _{non-ag, lim}	γ _Uhr	γ _{Ulr, agg}	R _{h , 1}, нм	R _{h, 2}, нм	I ₂, имп. / С
60	19 ± 1	0,51 ± 0,01	—	11,1 ± 0,1	(3,2 ± 0,1) ∙ 10 ³
65	13,6 ± 0,6	0,35 ± 0,01	0,51 ± 0,03	0,51 ± 0,03 905 ± 0,01
10,3 ± 0,3	12,8 ± 0,3	(5,1 ± 0,1) ∙ 10 ³
70	1,6 ± 0,1	0,05 ± 0,01	γ _Uhr + γ _{Ulr agg} = 0,95 ± 0,01		10,4 ± 0,4	15.1 ± 0,4	(12,1 ± 0,1) ∙ 10 ³
80	1,5 ± 0,1	0,06 ± 0,01	γ _Uhr + γ _{Ulr, agg} = 0,94 ± 0,01		—	—	—

Исследование кинетики термической агрегации БСА с использованием AF4

При изучении кинетики термической агрегации БСА доля неагрегированного белка определялась с использованием AF4. В качестве примера приведены фрактограммы интактного БСА (кривая 1) и предварительно нагретого до 65 ° С БСА для разных интервалов времени (кривые 2–5).Основной пик интактного БСА соответствует мономерной форме. Есть два дополнительных пика, соответствующих димерной и тримерной формам. Суммарная площадь под всеми пиками (в интервале времени элюирования от 12 до 17 мин) дает количество интактного БСА. Следует отметить, что этот интервал времен элюирования соответствует молекулярным массам частиц от 64,5 до примерно 200 кДа [47]. В случае предварительно нагретого BSA белок, определенный количественно из области под фрактограммой в вышеупомянутом интервале времени элюирования, был условно назван «неагрегированным белком».Очевидно, что мы имеем дело с белком, остающимся не включенным в агрегаты большого размера. Характеристики неагрегированного белка будут даны в следующих разделах.

Фрактограммы БСА (1 мг / мл), предварительно нагретого до 65 ° C.

Время нагрева было следующим: (1) 0, (2) 5, (3) 15, (4) 90 и (5) 600 мин. Условия AF4: 23 ° C, осевой поток (детектор) 1 мл / мин, фокусный поток 5 мл / мин, поперечный поток 5 мл / мин в течение 10 минут, а затем линейный спад до 0,1 мл / мин в течение 20 минут плюс 8 минут при 0 мл / мин.

Зависимости доли неагрегированного белка (γ _non-agg) от времени, полученные при 60 ° C, 65 ° C, 70 ° C и 80 ° C, представлены в. Особый интерес представляет то, что при достаточно высоких значениях времени доля неагрегированного белка при каждой температуре приближается к предельному значению, отличному от нуля (γ _{non-agg, lim}). Эти предельные значения, обозначенные пунктирными линиями в, были определены путем экстраполяции значений γ _non-agg на t → ∞ в координатах {γ _non-agg; 1/ т }.Значения γ _{non-agg, lim}, рассчитанные таким образом, соответствуют той части развернутого белка, которая остается не включенной в агрегаты большого размера в течение длительного времени. Когда температура инкубации увеличивается с 60 ° C до 80 ° C, значение неагрессивного γ _{, lim} уменьшается с 0,51 до 0,06 ().

Кинетика термической агрегации БСА при (A) 60 ° C, (B) 65 ° C, (C) 70 ° C и (D) 80 ° C.

Зависимости доли неагрегированного белка (γ _non-agg) от времени.Значения γ _non-agg были рассчитаны на основе данных AF4. Пунктирные горизонтальные линии соответствуют значениям γ _{non-agg, lim}. Пунктирная линия на панели B соответствует значению γ _Ulr = 1 –γ _Uhr.

Ценная информация о начальной стадии агрегации БСА может быть получена из графика зависимости доли агрегированного белка от доли денатурированного белка. Долю агрегированного белка (γ _agg) рассчитывали как (1 –γ _non-agg), а долю денатурированного белка (γ _den) рассчитывали как (1 –γ _nat).показывает графики γ _agg и γ _den, полученные при 60 ° C, 65 ° C, 70 ° C и 80 ° C. Особое внимание было уделено (65 ° C). При этой температуре соотношение между γ _agg и γ _den является линейным. Это означает, что развернутый белок быстро агрегирует без накопления в растворе (скорость агрегации значительно превышает скорость денатурации). Длина, отсеченная на вертикальной линии, проходящей через γ _den = 1 линейной зависимостью γ _agg от γ _den, дает долю развернутого белка, участвующую в стадии быстрой агрегации (γ _Uhr, часть высокореактивного развернутого белка).При 65 ° C γ _Uhr равен 0,51 ± 0,03 (). Остальная часть белка (1 –γ _Uhr) участвует в процессе агрегации с относительно низкой скоростью и может быть названа низкореактивным развернутым белком (γ _Ulr). При 65 ° C значение γ _Ulr равно 0,49. Учитывая, что при этой температуре γ _{non-ag, lim} = 0,35, можно сделать вывод, что доля низкореакционной развернутой формы, участвующая в образовании агрегатов большого размера (γ _{Ulr, agg}), равна 1 –γ _Uhr −γ _{неагрессивный, lim} = 0.14 ().

Взаимосвязь между частями агрегированного белка (γ _agg) и денатурированного белка (γ _den).

Графики γ _agg vs γ _den построены при (A) 60 ° C, (B) 65 ° C, (C) 70 ° C и (D) 80 ° C. Значения γ _den = 1 –γ _nat были рассчитаны по формуле 4. Для каждого температурного параметра B , k _{1, den} и k _{2, den}, указанных на соответствующих панелях были использованы.График γ _agg против γ _den при 65 ° C (панель B) был использован для определения доли высокореакционной формы BSA (γ _Uhr) при этой температуре.

На основе анализа взаимосвязи между частью агрегированной белковой формы и частью денатурированной формы можно предположить, что денатурация нативной формы (N) приводит к образованию двух развернутых видов, проявляющих различную склонность к агрегации. Высокореактивная форма (U _час) характеризуется высокой скоростью агрегации.Низкореактивная развернутая форма (U _lr) участвует в процессе агрегации посредством прикрепления к агрегатам большого размера или образования стабильных агрегатов малого размера в результате самоагрегации. В недавней статье Rombouts et al. [48] было показано, что нагревание БСА приводит к перетасовке дисульфидных связей в молекуле белка за счет реакций обмена SH-SS. С большой долей вероятности формы U _hr и U _lr различаются по дисульфидному спариванию.

Механизм термической агрегации БСА.

Первым этапом общего процесса агрегации является разворачивание нативной формы (N), что приводит к образованию двух форм развернутого белка с различной склонностью к агрегации. Одна из форм (высокореакционная развернутая форма, U _час) характеризуется высокой скоростью агрегации; агрегация приводит к образованию первичных агрегатов с гидродинамическим радиусом ( R _{h, 1}). Вторая форма (низкореактивная развернутая форма, U _lr) участвует в процессе агрегации путем присоединения к первичным агрегатам, продуцируемым формой U _hr, и обладает способностью к самоагрегации с образованием устойчивых агрегатов небольшого размера ( А _st).Форма A _st соответствует неагрегированным развернутым видам BSA в экспериментах с AF4. При полном исчерпании формы U _lr образуются вторичные агрегаты с гидродинамическим радиусом ( R _{h, 2}). Дальнейшая агрегация белка происходит в результате слипания вторичных агрегатов.

Исследование кинетики термической агрегации BSA с использованием DLS

Дополнительная информация о кинетике агрегации BSA была получена DLS.Этот метод позволяет регистрировать изменение интенсивности светорассеяния и гидродинамического радиуса ( R _h) белковых агрегатов в процессе агрегации. В первую очередь целесообразно обсудить зависимости R _h от времени. Эти зависимости представлены в. Как упоминалось выше, высокореакционная развернутая форма преобразуется в агрегированное состояние после завершения денатурации. Образовавшиеся агрегаты можно назвать первичными агрегатами (). Для оценки гидродинамического радиуса первичных агрегатов ( R _{h, 1}), R _h в зависимости от доли денатурированного белка (γ _den) должны быть построены графики.Эта процедура действительна при температурах 65 ° C и 70 ° C (). Длина, отрезанная на вертикальной линии, проходящей через γ _den = 1.0 по линейной зависимости R _h от γ _den, соответствует R _{h, значение 1}: R _{h, 1} = 10,3 ± 0,3 нм при 65 ° C и R _{h, 1} = 10,4 ± 0,4 нм при 70 ° C. Следует отметить, что при 60 ° C и 80 ° C () определение размера первичных агрегатов невозможно.

Зависимости гидродинамического радиуса ( R _h) от времени для агрегации БСА при (A) 60 ° C, (B) 65 ° C, (C) 70 ° C и (D) 80 ° C.

Пунктирные горизонтальные линии на панелях A, B и C соответствуют значениям R _{h, 1} или R _{h, 2}, рассчитанным из зависимостей R _h от участков денатурированного и агрегированный BSA, соответственно. Сплошная кривая на панели D рассчитана по формуле 3 при d _f = 1.76.

Зависимости гидродинамического радиуса ( R _h) от доли денатурированного белка (γ _den) для агрегации БСА при (A) 60 ° C, (B) 65 ° C, ( C) 70 ° C и (D) 80 ° C.

Значения γ _den были рассчитаны по формуле 4. Для каждого температурного параметра были использованы B , k _{1, den} и k _{2, den}, указанные на соответствующих панелях. Графики R _h vs γ _den при 65 ° C и 70 ° C (панели B и C) были использованы для определения гидродинамического радиуса первичных агрегатов ( R _{h, 1} ).

Как указывалось выше, при 65 ° C часть низкореакционной развернутой формы (обозначенная как γ _{Ulr, agg}) может вовлекаться в процесс агрегации путем присоединения к агрегатам большого размера. В соответствии с этим мы предполагаем, что U _lr прикреплен к первичным агрегатам, и этот процесс завершается образованием вторичных агрегатов по мере того, как U _lr исчерпывается. Образование вторичных агрегатов можно рассматривать как гетерогенное зародышеобразование [49,50].В этом случае на поверхности первичного агрегата образуется зародыш, а рост агрегата происходит в результате присоединения развернутых мономеров к гетерогенному зародышу. Гетерогенное зародышеобразование может объяснить тот факт, что стадии образования первичных и вторичных агрегатов разделены во времени.

Таким образом, первичные агрегаты действуют как затравки для дальнейшего роста агрегатов путем добавления развернутых мономеров. Такая посевная функция сформированных агрегатов БСА недавно обсуждалась Sahin et al.[33].

Для расчета гидродинамического радиуса вторичных агрегатов ( R _{h, 2}) необходимо построить график зависимости R _h от γ _agg. Значение (γ _Uhr + γ _{Ulr, agg}) по оси абсцисс соответствует завершению стадии образования вторичных агрегатов. Таким образом, отрезок длины на вертикальной линии, проходящей через γ _agg = (γ _Uhr + γ _{Ulr, agg}) по линейной зависимости R _h от γ _agg, дает R _{ч, значение 2} (11.1 ± 0,1 нм при 60 ° C, 12,8 ± 0,3 нм при 65 ° C и 15,1 ± 0,4 нм при 70 ° C; ,).

Зависимости гидродинамического радиуса ( R _h) от доли агрегированного белка (γ _agg) для агрегации БСА при (A) 60 ° C, (B) 65 ° C, (C) 70 ° C и (D) 80 ° C.

Вертикальные пунктирные линии соответствуют γ _agg = γ _Uhr + γ _{Ulr, agg}. Графики R _h против γ _den при 60 ° C, 65 ° C и 70 ° C (панели A – C) были использованы для определения гидродинамического радиуса вторичных агрегатов ( R _{ч, 2}).

Полученные экспериментальные данные позволяют предположить, что при 65 ° C процесс агрегации включает три стадии, которые заметно разделены во времени: разворачивание БСА, образование первичных агрегатов и образование вторичных агрегатов. Это обстоятельство позволяет определить долю отдельных форм U _hr и U _lr, а также размеры первичных и вторичных агрегатов ( R _{h, 1} и R _{h, 2}) при данной температуре. .При 60 ° C скорости денатурации и агрегации становятся соизмеримыми, и определение отдельных частей высоко и низкоактивных форм развернутого белка невозможно. При 70 ° C скорости образования первичных и вторичных агрегатов становятся соизмеримыми. При 80 ° C анализ кинетики агрегации БСА осложняется образованием агрегатов крупных размеров (эта проблема будет рассмотрена ниже). Следует отметить, что экспериментальные данные позволяют оценить долю развернутого белка, которая длительное время остается не включенной в агрегаты большого размера (γ _{non-agg, lim}) при всех исследуемых температурах ().Кроме того, гидродинамический радиус вторичных агрегатов ( R _{h, 2}) при 60 ° C и 70 ° C можно оценить по графикам R _h в сравнении с графиками γ _agg. При 80 ° C определение размера вторичных агрегатов невозможно.

Как видно из рис. И, образование вторичных агрегатов не является завершающей стадией процесса агрегации, и размер агрегатов продолжает монотонно увеличиваться во времени. Таким образом, представленную схему следует дополнить этапом налипания вторичных агрегатов.Особенно заметно образование крупногабаритных агрегатов при 80 ° C. При t > t * = 140 мин и R _h> Rh * = 35 нм зависимость R _h от времени следует уравнению 3 с d _f = 1,76 ± 0,06 Это свидетельствует о том, что прилипание агрегатов происходит в кинетическом режиме DLCA.

показывает зависимости интенсивности светорассеяния ( I ) от времени, полученные для агрегации БСА при 60 ° C, 65 ° C, 70 ° C и 80 ° C.Как видно, значение I монотонно увеличивается во времени. Такое монотонное увеличение связано с тем, что процесс агрегации не останавливается на стадии образования вторичных агрегатов БСА, а продолжается в результате прилипания вторичных агрегатов. Для оценки уровня интенсивности светорассеяния ( I ₂), соответствующего полному переходу высокореактивных и низкоактивных развернутых форм в агрегированное состояние, были построены графики зависимости интенсивности от γ _agg ().Анализ этих графиков показывает, что зависимость интенсивности светорассеяния от γ _agg подчиняется квадратичному закону:

I = I0 + I2 − I0 (γUhr + γUlr, agg) 2 γagg2,

(5)

где I ₀ — начальное значение интенсивности светорассеяния. Были найдены следующие значения I ₂: (3,2 ± 0,1) · 10 ³, (5,1 ± 0,1) · 10 ³ и (12,1 ± 0,1) · 10 ³ отсчетов / с при 60 ° C, 65 ° C и 70 ° C соответственно.Пунктирные горизонтальные линии соответствуют расчетным значениям I ₂. Следует отметить, что при 80 ° C достоверная оценка значения I ₂ невозможна, хотя начальный участок зависимости интенсивности светорассеяния от γ _agg можно описать квадратичным законом.

Зависимости интенсивности светорассеяния от времени для агрегации БСА при (A) 60 ° C, (B) 65 ° C, (C) 70 ° C и (D) 80 ° C.

Пунктирные горизонтальные линии на панелях A, B и C соответствуют значениям I ₂, вычисленным из зависимостей интенсивности светорассеяния от доли агрегированного БСА.

Зависимости интенсивности светорассеяния ( I ) от доли агрегированного белка (γ _agg) для агрегации БСА при (A) 60 ° C, (B) 65 ° C, (C) 70 ° C и (D) 80 ° C.

Вертикальные пунктирные линии соответствуют γ _agg = (γ _Uhr + γ _{Ulr, agg}). Для определения параметра I ₂, соответствующего значению интенсивности светорассеяния после завершение образования вторичных агрегатов БСА.Сплошные линии рассчитаны по формуле 5.

Тот факт, что интенсивность светорассеяния ( I ) и доля агрегированного белка (γ _agg) связаны квадратным уравнением, позволяет преобразовать экспериментальную зависимость I от времени в кинетической кривой накопления агрегированного белка: γ _agg = const ( I / I ₀ −1) ^0,5. Такой подход может быть использован для расчета начальной скорости агрегации и, следовательно, для скрининга агентов, действующих как супрессоры агрегации белков.

Исследование полидисперсности нагретых препаратов BSA с использованием AUC

AUC использовали для характеристики полидисперсности термообработанных препаратов BSA. показывает распределение дифференциальных коэффициентов седиментации c ( s ) для интактного препарата BSA. Основной пик с s _{20, w} = 4,58 ± 0,12 S и M = 69,5 кДа соответствует мономерной форме BSA. Содержание мономерной формы 90,5%. Распределение c ( s ) также содержит второстепенный пик с s _{20, w} = 6.50 ± 0,11 S, что соответствует димерной форме.

Седиментационные свойства нативного BSA при 20 ° C.

Дифференциальные распределения коэффициента седиментации c ( s ) для BSA (1 мг / мл). На вставке показано распределение c ( M ). Скорость вращения ротора 48000 об / мин.

Распределения c ( s ) для препарата BSA, предварительно нагретого в течение 12 часов при 60 ° C, 65 ° C, 70 ° C и 80 ° C, представлены в. Следует отметить, что согласно данным, показанным в при t = 12 ч, часть неагрегированного белка достигает постоянного уровня, соответствующего части развернутого белка, которая остается не включенной в агрегаты большого размера в течение длительного времени. время (γ _{non-ag, lim}) при каждом исследуемом значении температуры.В случае предварительно нагретого до 60 ° C препарата БСА () неагрегированный белок представлен мономерной формой с с _{20, w} = 4,9 ± 0,4 S (40%) и димерной формой с с _{20, w} = 6,8 ± 0,5 S (9%). Помимо мономерной и димерной форм распределения c ( s ) содержат набор пиков, соответствующих агрегатам BSA (50,7%). Последние характеризуются высокой полидисперсностью. Средневзвешенный коэффициент седиментации ( с _av) для агрегатов оказался равным 16.3 S (стандартное отклонение 4.3 S). Таким образом, доля неагрегированного белка равна 0,49 и хорошо согласуется с долей неагрегированного белка (γ _{non-agg, lim}), определенной с помощью AF4 ().

Седиментационная характеристика БСА (1 мг / мл), предварительно инкубированного в течение 12 часов при (A) 60 ° C, (B) 65 ° C, (C) 70 ° C и (D) 80 ° C.

Распределения c ( s ) и ls-g * ( s ) были получены при 24 ° C. Скорость вращения ротора 52000 об / мин.

Распределения c ( s ) для BSA, предварительно нагретого до 65 ° C и 70 ° C (), и распределение ls-g * ( s ) для BSA, предварительно нагретого до 80 ° C (), содержат пики с s _{20, ширина} = 5.3–5,4 S, соответствующие неагрегированному белку, включающему развернутые мономерные и димерные формы, и широкие пики, соответствующие агрегатам белка. Процент неагрегированного белка снижается с 21,6% до 2,4%, когда температура инкубации увеличивается в интервале от 65 ° C до 80 ° C.

Как видно из, при более высоких температурах инкубации раствора БСА образуются агрегаты более высокого порядка. Значения s _av, рассчитанные для агрегированных форм при 65 ° C, 70 ° C и 80 ° C, составили 21.6 S (стандартное отклонение. 6,1 S), 27,8 S (стандартное отклонение. 7,5 S) и 96 S (стандартное отклонение. 38 S) соответственно. Количество агрегированных форм увеличивалось одновременно с увеличением размера белковых агрегатов.

Изучение морфологии термически обработанных препаратов БСА с использованием ТЕМ

Для характеристики морфологии предварительно нагретых препаратов БСА с помощью ПЭМ изучали структуру образовавшихся агрегатов. Препараты БСА инкубировали при 65 ° C в течение 110 или 330 мин. Эти временные интервалы соответствуют завершению образования первичных или вторичных агрегатов соответственно (см.).При времени инкубации, равном 110 мин, образовывались короткие изогнутые фибриллы длиной около 40 нм (). На ПЭМ-изображении, полученном для препарата БСА, предварительно нагретого в течение 330 мин, наблюдаются агрегаты различной формы, включая фибриллы, сферы и фибриллы с лампочкой на одном конце (). Соответственно, образование этих агрегатов (вторичных агрегатов) происходит в результате присоединения развернутых молекул к первичным агрегатам.

ПЭМ-изображения препаратов BSA, предварительно нагретых при 65 ° C в течение 110 мин (A) и 330 мин (B).

Концентрация БСА составляла 1 мг / мл. Предварительно нагретый в течение 110 мин препарат промывали деионизированной водой. Изображение на панели B содержит частицы вируса табачной мозаики (TMV).

Взаимодействие термообработанного BSA с ThT

Holm et al. [34] наблюдали заметное усиление испускания флуоресценции ThT при 482 нм, когда фибрилло-специфический краситель добавлялся к раствору БСА, инкубированному при 70 ° C (20 мМ Трис, pH 7,4). Концентрация БСА в этих экспериментах составляла 2,5 мг / мл. На основании полученных данных авторы пришли к выводу, что БСА склонен к образованию амилоидоподобных фибрилл в исследованных условиях.Принимая во внимание эти результаты, представляло интерес проверить амилоидную фибрилляцию БСА в 0,1 М Na-фосфатном буфере, pH 7,0, при [BSA] = 1 мг / мл. После 12 ч нагревания BSA (1 мг / мл) при 60 ° C, 65 ° C, 70 ° C и 80 ° C каждый раствор BSA инкубировали с ThT в течение 30 минут при 25 ° C. Конечные концентрации BSA и ThT составляли 0,4 мг / мл и 20 мкМ соответственно. Принято считать, что значительное усиление флуоресценции ThT свидетельствует об образовании амилоидных фибрилл, которые характеризуются структурой, богатой поперечными β-слоями [51–53].Как видно из, незначительные изменения флуоресценции ThT происходят при связывании ThT с нагретым БСА. Максимальное увеличение флуоресценции ThT, а именно 6-кратное, наблюдалось для БСА, предварительно инкубированного при 80 ° C. Таким образом, было бы неразумно предполагать, что амилоидные фибриллы БСА могут образовываться в условиях, установленных для всех экспериментов в настоящей работе.

Спектры флуоресценции ThT (20 мкМ; кривая 1) и раствора ThT, инкубированных с нагретым BSA (0,4 мг / мл) в течение 30 мин при 25 ° C.

БСА (1 мг / мл) предварительно инкубировали в течение 12 ч при 60, 65, 70 и 80 ° C (кривые 2–5 соответственно). Длина волны возбуждения 450 нм.

Выделение фракции неагрегированного развернутого БСА и ее характеристика

Для выделения фракции неагрегированного развернутого БСА (A _st дюйм) и изучения ее свойств предпочтение было отдано температуре инкубации 60 ° C для агрегации БСА, где доля этой формы была максимальной для исследованных температур (γ _{non-agg, lim} = 0.51; ). Аликвоты БСА добавляли к 0,1 М Na-фосфатному буферу, pH 7,0, предварительно нагретому до 60 ° C до конечной концентрации белка 1 мг / мл и инкубировали при 60 ° C в течение 12 часов. Затем образцы охлаждали до комнатной температуры (23 ° C) и концентрировали на микропробирках с фильтром Microcon (NMWL 50000) центрифугированием при 14000 g в течение 10 мин. Концентрацию белка в супернатанте определяли спектрофотометрически при 280 нм, используя коэффициент поглощения Acm1% 6,58 [39]. Затем полученный образец анализировали с помощью SEC.Данные SEC представлены на S1 рис. Пик со временем элюирования 70,8 мин (пик 1) соответствует агрегатам BSA большого размера. Молекулярная масса этой фракции, определенная с помощью калибровочного графика, составляет 300 кДа. Пик со временем элюирования 86 мин (пик 2) соответствует агрегатам БСА со средней молекулярной массой 151 кДа. Пик со временем элюирования 100,7 мин (пик 3) соответствует виду с молекулярной массой 77,6 кДа.

Данные по AUC подтверждают наш вывод, что пик 2 представлен небольшими агрегатами BSA.Распределение с ( с ) для фракции с временем элюирования в интервале от 82 до 94,6 мин включает набор пиков с с _{20, w} в диапазоне от 5,9 до 20,7 с (S2A рис.). Единственный пик с с _{20, w} = 5,2 с (63%) наблюдался для фракции с временем элюирования в интервале от 94,6 до 122 мин (S2B фиг.). Можно предположить, что пик 3 на профиле элюирования SEC содержит развернутую мономерную форму и небольшое количество развернутой димерной формы BSA.Измерения DLS показывают, что эта фракция характеризуется значением R _h 6,1 нм (S3B Рис). Полученное значение R _h превышает соответствующее значение для интактного BSA (3,4 нм; S3A Фиг.), Предполагая, что более высокое значение R _h для пика 3 связано с присутствием димерной формы.

Спектр флуоресценции триптофана для фракции БСА, полученной методом SEC, предварительно нагретой в течение 12 ч при 60 ° C со временем элюирования в интервале от 94.От 6 до 122 минут сравнивали с таковым для интактного БСА (S4, рис.). Как видно, неагрегированная развернутая форма (A _st) характеризуется пониженным значением интенсивности излучения Trp и сдвигом длины волны максимума излучения (λ _max) с 346 до 337 нм. Такой синий сдвиг удивителен, потому что разворачивание белков обычно приводит к смещению λ _max в сторону более высоких длин волн [54,55]. При нагревании БСА в интервале температур от 25 ° C до 80 ° C Sahin et al.[33] и Wen et al. [56] наблюдали синий сдвиг положения пика собственной триптофановой флуоресценции БСА. Голубой сдвиг спектра излучения триптофановой флуоресценции, наблюдаемый при тепловом разворачивании α-амилазы поджелудочной железы свиньи [55] и субфрагмента 1 миозина [57], был объяснен тем, что остатки Trp были введены в более гидрофобную среду в результате конформационной изменения белковой молекулы, сопровождающие ее развертывание. Можно предположить, что наблюдаемый синий сдвиг λ _max для формы BSA A _st обусловлен переносом остатков Trp в более гидрофобное окружение, вызванным димеризацией развернутых мономеров.

Дополнительная информация об изменении доступности гидрофобных сайтов в молекуле BSA во время термообработки может быть получена с помощью флуоресцентного зонда. Положение λ _max в спектре излучения свободного ANS соответствует 528 нм (длина волны возбуждения 445 нм). Для исследования взаимодействия БСА с ВНС использовалась длина волны возбуждения 380 нм [56]. В изученных условиях флуоресценция ANS незначительна (кривая 1 на фиг. S5), однако она заметно увеличивается в присутствии интактного БСА, что свидетельствует о наличии множества сайтов связывания ANS в молекуле белка.Связывание АНС с гидрофобными сайтами в молекуле БСА приводит к сдвигу положения λ _max до 484 нм (кривая 2). Интересно, что прирост интенсивности флуоресценции ВНС в присутствии неагрегированной развернутой фракции БСА (кривая 3) заметно ниже, чем в случае интактного БСА. Положение λ _max в системе A _st + ANS соответствует 476 нм. Таким образом, образование видов A _st не сопровождается размножением дополнительных гидрофобных сайтов в молекуле BSA.

Для оценки коллоидной стабильности нативного и неагрегированного развернутого БСА измеряли дзета-потенциал обоих препаратов. Значения дзета-потенциала для необработанного BSA и A _st оказались равными –20,9 ± 0,8 и –9,2 ± 0,4 мВ, соответственно. Дзета-потенциал нативного белка при pH и ионной силе, использованный в наших экспериментах, согласуется с литературными данными [58]. Более низкое абсолютное значение дзета-потенциала для A _st предполагает, что неагрегированная развернутая форма будет склонна к агрегации из-за более слабого электростатического отталкивания.Возможное объяснение неспособности A _st образовывать агрегаты в наших экспериментальных условиях заключается в том, что, как показали эксперименты с флуоресцентным зондом ANS, не возникает появления дополнительных гидрофобных сайтов во время разворачивания нативной формы.

Спектры КД нативного и неагрегированного развернутого БСА представлены на рис. S6. Содержание элементов вторичной структуры оценивалось с помощью программного обеспечения, доступного онлайн на сервере DichroWeb (http: // dichroweb.крист.bbk.ac.uk). Для расчета мы использовали две программы анализа, CONTIN [59] и SELCON [60], с двумя наборами эталонных белков (набор 3 и SP175, 190–240). Результаты, полученные с разными наборами эталонных белков, были аналогичными. Средние значения всех подходящих решений для обеих программ приведены в таблице S1. Было обнаружено, что значения нормированного среднеквадратичного отклонения (NRMSD) для обоих фитингов не превышают 0,1 [40].

Данные, полученные с помощью программ CONTIN и SELCON, показывают, что доля α-спиралей во вторичной структуре необработанного БСА равна 0.49. BSA в нативном состоянии преимущественно имеет α-спиральную структуру [9], и это согласуется с нашими результатами. Предварительный нагрев при 60 ° C в течение 12 ч приводит к заметному уменьшению доли α-спиралей на 22–37% и увеличению доли β-тяжей на 27–60%, доли витков на 13–25%. доля неупорядоченных структурных элементов на 12–24%.

Наблюдаемые изменения содержания α-спиралей типичны для термообработанного альбумина. Литературные данные показывают, что нагревание БСА до 65 ° C с постоянной скоростью [61] или инкубация при 90 ° C в течение 10 мин [62] сопровождается уменьшением доли α-спиралей.Zhang et al. [63] показали, что вторичная структура БСА может быть восстановлена после нагревания до 79,42 ° C и последующего охлаждения до комнатной температуры. Следует отметить, что термическая денатурация БСА включает обратимые и необратимые стадии [64]. В экспериментальных условиях, использованных в настоящей работе (нагревание в течение 12 ч при 60 ° C), БСА денатурировался полностью и необратимо, о чем свидетельствуют данные, представленные в которых демонстрируют необратимую стадию денатурации.

Заключение

Анализ соотношения частей агрегированного и денатурированного белка позволил сделать вывод о кинетическом режиме термической агрегации белков.Используя этот подход, мы продемонстрировали, что лимитирующая стадия агрегации БСА при 65 ° C является стадией разворачивания белка. При более высоких температурах (например, при 80 ° C) стадия агрегации молекул денатурированного белка становится лимитирующей стадией.

Ранее нами было показано, что тест-система, основанная на дитиотреитол-индуцированной агрегации БСА, может быть использована для тестирования антиагрегационной активности шаперонов белковой природы и низкомолекулярных химических шаперонов [47].Результаты, полученные в настоящей статье, демонстрируют, что индуцированная нагреванием агрегация BSA также может быть полезна для разработки тест-системы, предназначенной для скрининга агентов, которые обнаруживают способность подавлять агрегацию белков. Основанием для этого намерения является тот факт, что для начальных участков кинетических кривых термической агрегации БСА интенсивность светорассеяния пропорциональна доле агрегированного белка, возведенной во вторую степень. Таким образом, измерения зависящих от времени изменений интенсивности светорассеяния позволяют количественно оценить антиагрегационную активность исследуемых агентов.

Что касается механизма термической агрегации БСА, то следует отметить, что характер зависимости гидродинамического радиуса белковых агрегатов от времени для агрегации БСА существенно отличается от такового для термической агрегации других белков, изученных нами ранее. При изучении термической агрегации GAPDH, гликогенфосфорилазы b и креатинкиназы из скелетных мышц кролика, β _L -кристаллина, белка оболочки вируса табачной мозаики, дрожжевой алкогольдегидрогеназы и митохондриальной аспартатаминотрансферазы с помощью DLS мы показали, что начальная стадия агрегация белков — это образование стартовых агрегатов с участием сотен денатурированных белковых молекул [7,42,65–71].Промежуточных состояний между формами нативного белка и стартовыми агрегатами не обнаружено. Иная ситуация наблюдается при термической агрегации БСА. В этом случае среднее значение гидродинамического радиуса белковых агрегатов монотонно увеличивается во времени. Следовательно, маловероятно предположить, что в этих условиях могут образовываться стартовые агрегаты. Стоит отметить, что кинетический механизм агрегации БСА, предложенный Sahin et al. [33] не содержит стадий образования зародышей и кластеров зародышей (типа стартовых агрегатов).

Закон о банковской тайне (BSA) | OCC

OCC предписывает правила, осуществляет надзорную деятельность и, при необходимости, принимает правоприменительные меры для обеспечения того, чтобы национальные банки имели необходимый контроль и предоставляли необходимые уведомления правоохранительным органам для предотвращения и выявления отмывания денег, финансирования терроризма и других преступных действий и неправомерное использование финансовых институтов нашей страны.

OCC проводит регулярные проверки национальных банков, федеральных сберегательных ассоциаций, федеральных отделений и агентств иностранных банков в США.S. для определения соответствия BSA.

OCC использует неформальные и формальные меры воздействия для обеспечения соблюдения национальными банками, федеральными сберегательными ассоциациями, федеральными филиалами и агентствами иностранных банков BSA. В соответствии с меморандумом о взаимопонимании между банковскими агентствами США и Сетью по борьбе с финансовыми преступлениями (FinCEN) Министерства финансов США и OFAC, OCC незамедлительно уведомит FinCEN и OFAC о существенных нарушениях или недостатках BSA.

Закон о банковской тайне (BSA), 31 USC 5311 et seq устанавливает требования к программам, ведению учета и отчетности для национальных банков, федеральных сберегательных ассоциаций, федеральных отделений и агентств иностранных банков.Правила реализации OCC находятся в 12 CFR 21.11 и 12 CFR 21.21. В BSA были внесены поправки с целью включения положений Закона США «PATRIOT», который требует, чтобы каждый банк принял программу идентификации клиентов как часть своей программы соответствия BSA.

В дополнение к использованию информации, представленной банками при расследовании случаев отмывания денег и финансирования терроризма, правоохранительные органы США также предоставляют банкам доступ к ресурсам и инструментам, перечисленным здесь, которые можно использовать для усиления ваших программ управления рисками BSA / AML.

OCC и Министерство финансов США периодически выпускают предупреждения, рекомендации и правила, касающиеся организаций или лиц, которые могут быть вовлечены в мошенническую деятельность или могут считаться объектами высокого риска для деятельности по отмыванию денег или финансированию терроризма.

Банки США играют ключевую роль в борьбе с финансированием терроризма, выявляя и сообщая о потенциально подозрительной деятельности в соответствии с требованиями BSA. В этом вам поможет ряд ресурсов.

Преступники уже давно используют схемы отмывания денег для сокрытия или «очистки» источника полученных или украденных средств обманным путем. Отмывание денег создает значительные риски для безопасности и устойчивости финансовой индустрии США. С появлением террористов, которые используют методы отмывания денег для финансирования своих операций, риск расширяется и охватывает безопасность нации. Благодаря надежным операциям банки играют важную роль, помогая следственным и регулирующим органам выявлять организации, занимающиеся отмыванием денег, и принимать соответствующие меры.

В соответствии с Законом о банковской тайне (BSA) и соответствующими законами о борьбе с отмыванием денег банки должны

Создание эффективных программ соответствия BSA
Создание эффективных систем надлежащей проверки клиентов и программ мониторинга
Проверка против Управления по контролю за иностранными активами (OFAC) и других государственных списков
Наладить эффективный процесс мониторинга подозрительной деятельности и отчетности
Разработка программ противодействия отмыванию денег с учетом рисков

С 1 апреля 2013 года финансовые учреждения должны использовать электронную систему подачи документов BSA Закона о банковской тайне для подачи отчетов о подозрительной деятельности.

Финансовое учреждение обязано подавать отчет о подозрительной деятельности не позднее, чем через 30 календарных дней после даты первоначального обнаружения фактов, которые могут служить основанием для подачи отчета о подозрительной деятельности. Если в день обнаружения инцидента, требующего регистрации, подозреваемый не был идентифицирован, финансовое учреждение может отложить заполнение отчета о подозрительной деятельности еще на 30 календарных дней, чтобы идентифицировать подозреваемого. Ни в коем случае представление отчета не должно задерживаться более чем на 60 календарных дней после даты первоначального обнаружения транзакции, подлежащей отчетности.

В соответствии с Законом о банковской тайне (BSA) финансовые учреждения обязаны оказывать правительственным учреждениям США помощь в обнаружении и предотвращении отмывания денег, например:

Вести учет покупок оборотных инструментов за наличные,
Подавать отчеты о кассовых операциях, превышающих 10000 долларов США (дневная совокупная сумма), и
Сообщить о подозрительной деятельности, которая может указывать на преступную деятельность (например, отмывание денег, уклонение от уплаты налогов)

Поправка к BSA включает положения Патриотического акта США, который требует, чтобы каждый банк принял программу идентификации клиентов как часть своей программы соответствия BSA.

Эндаумент

Планируемое пожертвование — Большинство из нас слышали о термине «пожертвование», но что он на самом деле означает?

Эндаумент — это фонд, удерживаемый бессрочно для выплаты процентов и дивидендов на благотворительные цели. Это определение из учебника, но на самом деле эндаумент — это спасательный круг благотворительной организации. В конце концов, наша миссия не в сборе средств, а в том, чтобы продолжить наше сильное движение и построить фундамент, который обеспечит нашу молодежь качественной программой, основанной на ценностях.Для получения дополнительной информации о планируемых пожертвованиях посетите bsagiftplan.org.

В знак признательности за такую поддержку, Бойскауты Америки на национальном уровне предлагают три различных награды за признание пожертвований, которые являются частью Общества наследия. Совет области Потаватоми вручает эти награды донорам, которые поддерживают финансовое будущее Скаутинга посредством подарков фонду.

Для получения дополнительной информации или для того, чтобы сделать подарок целевому фонду, обращайтесь: Конни Белински, ассистент. Scout Executive, 262-436-8419

ОБЩЕСТВО НАСЛЕДИЯ:

В состав Общества наследия входят все, кто сделал подарок в фонд пожертвований Совета в Доме Джеймса Э.Западный уровень (1000 долларов США) или выше. Это способ оставить в наследство Скаутингу в честь или в память о ком-то особенном.

The Founders Circle

Founders Circle предназначен для признания отложенных подарков, предназначенных для благотворительных фондов совета. Поскольку отсроченная раздача (также называемая плановой раздачей) так широко и эффективно используется многими донорами, BSA хочет признать важность таких крупных подарков. Доноры признаются за пожертвования на сумму 100 000 долларов и более. В отличие от других наград за признание пожертвований, донор может претендовать на членство с помощью подарков, сделанных через:

Благотворительное завещание в завещании или подзаконном акте
Благотворительные трасты, такие как паевые, аннуитетные и ведущие трасты
подарочные аннуитеты BSA или BSA Дары Фонда объединенного дохода
Назначение пенсионного плана / страхования жизни
Другие отложенные дары, утвержденные советом района Потаватоми

В круге учредителей есть четыре уровня членства

Бронзовые 100 000 долларов минимального обязательства по подарку
Серебро 250 000 долларов минимального подарка обязательство
Gold Обязательство по подарку минимум 500 000 долларов
Platinum Обязательство по подарку минимум 1 000 000 долларов

Регистрационная форма

Усилители серия BSA

Снижение уровня пиратства на 10% дает ИТ-индустрии дополнительные 142 млрд долларов

BSA Guns: новая пневматическая PCP-винтовка Ultra XL

Россия занимает 16 место в рейтинге BSA по готовности стран к облачным вычислениям

Пиратам недоплатили за софт – Газета Коммерсантъ № 85 (4140) от 15.05.2009

Все новостройки от «БСА» отзывы о компании «БСА»

Компания «БСА»

Виды деятельности компании

Квартиры первичного рынка от компании «БСА»

Особенности предложений компании

Как купить квартиру в новостройке?

Каминная топка Dovre 2400 BSA

Каминная топка Dovre 2400 BSA

Чугунная топка Dovre 2400 BSA – залог тепла в вашем доме

Эксплуатационные характеристики оборудования Dovre 2400 BSA

Бычий сывороточный альбумин — обзор

BSA и cBSA

Большой день дарения

Совет Южной Флориды, Бойскауты Америки

ПОЖЕРТВОВАТЬ СЕЙЧАС

способов дарить — Los Padres Council BSA

Кинетика термической денатурации и агрегации бычьего сывороточного альбумина

Abstract

Введение

Материалы и методы

Материалы

Эксклюзионная хроматография

Калориметрические исследования

Просвечивающая электронная микроскопия

Спектроскопия кругового дихроизма

Измерения флуоресценции

Измерения дзета-потенциала

Измерения интенсивности светорассеяния

Аналитическое ультрацентрифугирование

Анализ данных

Результаты и обсуждение

Кинетика термической денатурации BSA

Таблица 1

Исследование кинетики термической агрегации БСА с использованием AF4

Исследование кинетики термической агрегации BSA с использованием DLS

Исследование полидисперсности нагретых препаратов BSA с использованием AUC

Изучение морфологии термически обработанных препаратов БСА с использованием ТЕМ

Взаимодействие термообработанного BSA с ThT

Выделение фракции неагрегированного развернутого БСА и ее характеристика

Заключение

Закон о банковской тайне (BSA) | OCC

Эндаумент

Планируемое пожертвование — Большинство из нас слышали о термине «пожертвование», но что он на самом деле означает?

ОБЩЕСТВО НАСЛЕДИЯ:

Добавить комментарий Отменить ответ