Формула гамма аминомасляная кислота: — (Acidum gammaaminobutyricum)- , , , .

для ПЦР в реальном времени были разработаны с использованием PrimerBLAST. GAD1 (NM_000817.2), но не 18S рРНК ( RNA18S5 ; NR_003286.2), была сконструирована через соединение интрон-экзон. У выбранных праймеров не было предсказанной амплификации вне мишени в геноме человека. Температура плавления грунтовки была рассчитана от 61 ° C до 63 ° C. Праймеры тестировали с помощью ПЦР из кДНК, синтезированной из клеточных линий NCI-H660 и LNCaP. Ампликоны ожидаемой длины (GAD1∶145 п.н .; 18S: 182 п.н.) были получены из препаратов кДНК и не были обнаружены в реакциях ПЦР с использованием геномной ДНК в качестве матрицы или только воды.Были построены кривые плавления и эффективность амплификации всех пар праймеров. Последовательности праймеров следующие: GAD1 (прямой): 5′-ATGGGGTTCGCACAGGTCATCC-3 ‘, GAD1 (обратный): 5′-TCCATGAGGACAAACACTGGTGCA-3′; RNA18S5 (прямой): 5′-GGGCATTCGTATTGCGCCGC-3 ‘, RNA18S5 (обратный): 5′-GAATAACGCCGCCGCATCGC-3′.

ПЦР в реальном времени

выделяли из осадка быстро замороженных клеток с использованием набора RNeasy (Qiagen). После экстракции РНК все образцы РНК разделяли на аликвоты и хранили при -80 ° C.Все образцы РНК обрабатывали ДНКазой TURBO (Ambion) для удаления геномной ДНК. Вся РНК, использованная для количественной ПЦР, немедленно подвергалась обратной транскрипции с помощью набора iScript (BioRad). Чистоту кДНК оценивали с помощью ПЦР-амплификации 18S рРНК образца кДНК и отрицательного контроля образца РНК, в котором отсутствовала обратная транскриптаза. Все образцы, использованные для последующих экспериментов QPCR, не имели детектируемого загрязнения геномной ДНК, о чем свидетельствует отсутствие ампликона 18S после 40 циклов реакции без обратной транскриптазы.Каждый образец тестировали в трех экземплярах при 50 нг кДНК. ПЦР в реальном времени выполняли с мастер-миксом SYBR green (BioRad) и концентрацией специфического праймера 100 нМ, установленной в приборе для ПЦР Bio-Rad CFX96 (95 ° C в течение 10 мин, затем 40 циклов при 95 ° C в течение 30 с. , 61 ° C в течение 1 мин и 74 ° C в течение 1 мин). Праймеры 18S рРНК использовали в качестве внутреннего стандарта.

Эксперименты по метаболическому стрессу

Для экспериментов по лишению питательных веществ использовали среду DMEM / F12 без глюкозы, пирувата и глутамина (USBiological).В среду были добавлены следующие компоненты: инактивированная нагреванием диализованная сыворотка с отсечкой молекулярной массы 10 кДа (Sigma), 1% заменимых аминокислот (NEAA, Gibco), 5 нг / мл EGF (BDBiosciences) и 5 ​​нг / мл. bFGF (Sigma). При необходимости в специализированные среды добавляли глюкозу и глутамин (Gibco). Глюкозу добавляли в среду, используя стандартные концентрации препарата DMEM / F12, равные 17,5 мМ. Использовали глутамин в концентрации 6 мМ. Перед экспериментами по метаболическому стрессу клетки PNEC высевали с плотностью 400000 клеток на лунку в 12-луночный планшет с 1.5 мл стандартной питательной среды. Клеткам давали возможность расти в течение 24 часов. Затем среду заменяли на 1,5 мл стрессовой среды. Для всех экспериментов с pH-стрессом использовали обычные питательные среды PNEC без бикарбонатных буферов или буферов HEPES и модифицировали следующим образом. Для кислотного стресса добавляли 2- ( N -морфолино) этансульфоновую кислоту (MES), pH 6,5, до конечной концентрации 20 мМ. Для обычного pH добавляли HEPES, pH 7,4 до конечной концентрации 20 мМ и добавляли бикарбонат натрия до конечной концентрации 0.34 г / л. Для щелочного стресса добавляли трис (гидроксиметил) аминометан (Трис) pH 8,5 до конечной концентрации 20 мМ и добавляли бикарбонат натрия до конечной концентрации 0,34 г / л. Затем клетки инкубировали в увлажненной камере без CO ₂ при 37 ° C в течение 24 часов.

Подготовка образца

Подготовка образцов для ферментативного анализа была модифицирована по сравнению с ранее описанными методами [13], [26]. Для стрессовых экспериментов среду быстро отсасывали из лунок, а клетки промывали 1 мл PBS.Для экспериментов с кислотным и основным стрессом лунки промывали физиологическим раствором, забуференным до соответствующего pH с помощью 20 мМ MES или HEPES, как указано выше. Затем клетки лизировали в 200 мкл ледяного раствора для лизиса (50 мМ гидроксида натрия и 1 мМ EDTA) и осторожно встряхивали в течение 30 секунд. Затем добавляли равный объем 100 мМ соляной кислоты для подкисления лизата. Планшеты покрывали клейкой пленкой для ПЦР и инкубировали на водяной бане при 60 ° C в течение 30 минут для уничтожения активности эндогенного фермента, а также эндогенного NADH.После инкубации планшеты недолго центрифугировали при 100 × g (Allegra 6R; Beckman-Coulter) для удаления конденсата. Пленку удаляли и в каждую лунку добавляли 100 мкл 400 мМ трис-основания до общего объема 500 мкл лизата в каждой лунке (конечный pH приблизительно 8). Лизаты центрифугировали при 15000 × g в течение 5 минут для осаждения обломков, супернатанты собирали и замораживали при -80 ° C до дальнейшего использования.

Анализ на основе резазурина для определения ГАМК и янтарного полуальдегида

После оптимизации реагентов основная смесь для количественного определения ГАМК и янтарного полуальдегида (SSAL) в образцах состояла из 0.063 Ед / мл ГАМазы, 0,063 Ед / мл диафоразы, 6,25 мкМ резазурина, 100 мкМ никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ), 5 мМ альфа-кетоглутарата и 3,125 мкМ дитиотреитола (ДТТ) в 100 мМ трис-основании, pH 8,8. Мастермикс делали свежим перед каждым экспериментом.

Основная смесь для количественного определения только SSAL включала указанные выше реагенты, а также 50 мМ 2-аминоэтилгидросульфат, ингибитор компонента трансаминазы ГАМК в препарате фермента ГАМазы. Ингибитор добавляли к основной смеси на 10 минут при комнатной температуре перед добавлением основной смеси к образцам.Перед всеми экспериментами готовили свежий препарат ингибитора.

Аликвоты образца (10 мкл) добавляли в лунки 96-луночного планшета для культивирования с черным прозрачным дном (Costar) с последующим добавлением 90 мкл мастермикса с помощью электронной многоканальной пипетки. Две аликвоты одного и того же образца использовали для определения общего количества ГАМК плюс SSAL или только SSAL на одном планшете. Если не указано иное, реакцию проводили при комнатной температуре и защищали от света в течение 30 минут.Сигнал, полученный от резоруфина, флуоресцентного продукта резазурина, количественно оценивали с использованием микропланшетного ридера FLUOstar Optima (BMG Labtech) с набором фильтров для возбуждения 544 нм / эмиссии 590 нм (усиление 1327; 10 вспышек на лунку). Кинетические анализы выполнялись с циклами в 1 минуту.

Сигнал для общего ГАМК плюс SSAL в каждом образце вычитался из сигнала только SSAL, чтобы получить сигнал для ГАМК. Стандартные кривые для ГАМК и SSAL были построены для количественного определения и скорректированы для холостого опыта с присутствием и без присутствия 2-аминоэтилгидросульфата.Измерения GABA и SSAL были нормализованы к белку в лизатах, количественно определены с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA) (Pierce) с использованием стандартной кривой бычьего сывороточного альбумина. Данные обрабатывались с помощью GraphPad Prism. Группы, связанные с питательными веществами и pH, были проанализированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа и пост-теста Даннета для статистического анализа.

Анализ на основе резазурина для определения глутамата

Ферментативный анализ для определения глутамата выполняли, как описано ранее [41].Вкратце, компоненты реакции включали 10 мкМ резазурина, 4 Ед / мл глутаматдегидрогеназы, 0,25 Ед / мл глутамино-пировиноградной трансаминазы, 100 мкМ аланина, 0,5 мг / мл НАД + и 0,5 Ед / мл диафоразы в 100 мМ Трис-HCl, pH 7.5. 10 мкл вышеуказанных образцов добавляли к 90 мкл реакционной смеси, и анализы проводили в темноте при комнатной температуре. Сигнал резоруфина измеряли через 15 минут. Группы, связанные с питательными веществами и pH, были проанализированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа и пост-теста Даннета для статистического анализа.

Анализ ГАМазы на основе флуоресценции NAD (P) H

Анализ был модифицирован из Passoneau [26].Основная смесь состояла из 0,08 ед. / Мл ГАМазы, 5 мМ альфа-кетоглутарата, 500 мкМ НАДФ, 100 мкМ DTT и 4 мМ EGTA в 100 мМ пирофосфате натрия, pH 8,6. Аликвоты образца (10 мкл) добавляли в 96-луночные оптические планшеты (Falcon 353261), а затем 90 мкл мастер-смеси. Реакцию проводили при комнатной температуре в течение 1 часа и измеряли в FLUOstar Optima с набором фильтров возбуждения 340 нм / эмиссии 450 нм (усиление 2103, 10 вспышек на лунку).

Вестерн-блоттинг метаболических ферментов

клеток PNEC высевали, подвергали стрессу и промывали, как описано выше.100 мкл ледяного буфера RIPA (10 мМ Трис pH 8,0, 1 мМ EDTA, 0,5 мМ EGTA, 140 мМ хлорида натрия, 0,1% додецилсульфата натрия (SDS), 0,1% дезоксихолата натрия и 1% Triton X-100), содержащего Добавляли 1 мМ ортованадат натрия и фенилметилсульфонилфторид (PMSF). Клетки соскребали из лунок на льду и добавляли в микроцентрифужные пробирки. Образцы центрифугировали в течение 10 минут при 10000 × g при 4 ° C для удаления нерастворимого осадка. Белок определяли количественно с помощью анализа BCA, как описано выше.

Всего 30 мкг белка загружали в 4–12% полиакриламидный гель Бис-Трис (Bolt; Life Technologies) с восстанавливающим агентом в соответствии со спецификациями производителя.Гель переносили на иммобилоновую мембрану (Millipore) и блокировали фосфатно-солевым буфером, содержащим 5% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% твин-20. Были использованы следующие первичные антитела: анти-GAD1 (MAB5406; Millipore) в разведении 1-5000, анти-ALDH5A1 (HPA029716; Sigma) в разведении 1-1000, анти-GLUL (MAB302; Millipore) в разведении 1-1000 и анти-ACTB (ab8226; Abcam) при разведении 1-4000. Первичные антитела инкубировали в течение ночи при 4 ° C. Затем использовали вторичные козьи антимышиные или антикроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (Cell Signaling) при разведении 1-5000.Тот же блот использовали для проверки экспрессии всех белков. После использования каждого антитела блот очищали с помощью Western Re-probe (G Biosciences) в соответствии со спецификациями производителя. Блоты были проявлены и визуализированы с использованием набора для обнаружения WesternBright Quantum (Advansta).

Ферментативные анализы

клеток PNEC высевали, подвергали стрессу и промывали, как описано выше. Клетки соскабливали в 100 мкл ледяного буфера для лизиса (100 мМ фосфат натрия, pH 7,0, 20 мкМ пиридоксальфосфат и 0.1% тритон Х-100) и повторяли второй раз для каждой лунки. Образцы кратковременно обрабатывали ультразвуком (2–3 секунды) на льду, а затем центрифугировали в течение 10 минут при 10 000 × g при 4 ° C для удаления нерастворимого материала. Перед количественным анализом образцов все анализы оценивали на линейность в отношении времени и количества добавленного лизата. Все ферментативные активности были нормализованы по времени и количеству белка в лизате. Статистический анализ проводился, как описано выше.

Анализ глутаматдекарбоксилазы.

Метод был изменен по сравнению с исходным протоколом [42]. Буфер для анализа содержал 100 мМ фосфата натрия с pH 7,0, 250 мкМ пиридоксальфосфата, 50 мМ глутамата и 0,4% бета-меркаптоэтанола. Для каждого образца проводили холостую реакцию, которая не содержала пиридоксальфосфата или глутамата. 50 мкл лизата добавляли к 50 мкл реакционного буфера в планшете для ПЦР и инкубировали до 8 часов при 37 ° C в термоциклере без подогреваемой крышки. Анализ завершали добавлением 17 мкл 350 мМ HCl и нагревали в течение 30 минут при 60 ° C в термоциклере.Планшет снимали и ненадолго центрифугировали для удаления конденсата. Для нейтрализации образца добавляли 17 мкл 400 мМ трис-основания и центрифугировали планшет в течение 10 минут при 1000 × g для удаления белкового осадка. Затем лунки разбавляли в десять раз для измерения ГАМК, продукта ферментативной реакции, с использованием анализа ГАМК-резазурин, как описано выше.

Анализ глутаминсинтетазы.

Метод был модифицирован по сравнению с исходным протоколом с использованием спектрофотометрического определения γ-глутамилгидроксамата [43].Буфер для анализа содержал 50 мМ имидазольный буфер, pH 6,8, 50 мМ гидроксиламин, pH 6,8, 100 мМ глутамин, 25 мМ арсенат натрия, 0,2 мМ аденозиндифосфат (ADP) и 0,5 мМ хлорид марганца. Для каждого образца проводили холостую реакцию, которая не содержала арсената, АДФ или глутамина. 10 мкл лизата добавляли к 90 мкл реакционного буфера в планшете для ПЦР и инкубировали до 8 часов при 37 ° C в термоциклере без подогреваемой крышки. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл проявляющего реагента (0.37 М хлорид железа (III), 0,3 М трихлоруксусная кислота, 0,6 М HCl). Образцы центрифугировали для удаления осадка и измеряли оптическую плотность при 505 нм. Поглощение образца калибровали с помощью стандарта γ-глутамилгидроксамата.

Анализ ALDH5A1 (SSADH).

Метод был изменен по сравнению с предыдущими протоколами [26], [44]. Буфер для анализа содержал 100 мМ Трис pH 8,8, 50 мМ хлорид калия, 1 мМ дитиотреитол, 2,5 мМ никотинамидадениндинуклеотид (НАД), 1,25 мМ SSAL и 0,02% бычий сывороточный альбумин.Для каждого образца проводили холостую реакцию, не содержащую SSAL. 10 мкл лизата добавляли к 90 мкл реакционного буфера в планшете для ПЦР и инкубировали до 8 часов при 45 ° C в термоциклере без подогреваемой крышки. Реакции переносили на микропланшет и измеряли поглощение NADH, ферментативного продукта, при 355 нм. Поглощение образца калибровали по стандарту НАДН.

Результаты

Клинические последствия шунта ГАМК

Мы ранее определили с помощью анализов экспрессии, что синтез ГАМК обогащен злокачественными новообразованиями высокой степени злокачественности [13], и подтвердили наличие функционального шунта ГАМК в линии клеток рака предстательной железы (PNEC), используя комбинацию профилей экспрессии генов, метаболитов и количественное определение активности ферментов [13], [25].ГАМК может быть получена из промежуточных продуктов цикла трикарбоновых кислот (ТСА) и продуктов полиамин / катионные аминокислоты, которые связывают метаболизм ГАМК с несколькими путями клеточного энергетического метаболизма (, рис. 1, ). В одном из путей ГАМК продуцируется посредством декарбоксилирования глутамата декарбоксилазы 1 (GAD1) ​​глутамата, полученного из глутамина или альфа-кетоглутарата из цикла TCA. По второму пути продукты разложения полиамина и катионных аминокислот через путресцин подвергаются окислительно-восстановительному превращению в ГАМК.Затем ГАМК может метаболизироваться аминобутираттрансаминазой (ABAT, GABA-T) и полуальдегиддегидрогеназой янтарной кислоты (ALDH5A1, SSADH) в сукцинат для вступления в цикл TCA.

Рис. 1. Пути синтеза и метаболизма ГАМК в клетках NE.

GLUD: глутаматдегидрогеназа; GLS: глутаминаза; GLUL: глутамат-аммиачная лигаза; GAD1: глутаматдекарбоксилаза; ODC1: орнитиндекарбоксилаза; ABP1: диаминоксидаза; ABAT: трансаминаза ГАМК; SSAL: янтарный полуальдегид; ALDH5A1: полуальдегиддегидрогеназа янтарной кислоты; ALDH9A1: альдегиддегидрогеназа; SAT1: спермидин / спермин N-ацетилтрансфераза.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088667.g001

Во-первых, чтобы определить, обнаруживается ли избыточная экспрессия шунтирующих ферментов ГАМК при злокачественных новообразованиях предстательной железы человека и коррелирует ли избыточная экспрессия с неблагоприятными клиническими явлениями, мы использовали cBioPortal [37 ], [38] TCGA, чтобы опросить общедоступный набор данных по экспрессии генов рака простаты и соответствующую клиническую информацию [39] для когорт пациентов, у которых рак сверхэкспрессирует компоненты шунта ГАМК.Из всех ферментов, перечисленных на рис. 1, GAD1 был единственным геном, избыточная экспрессия которого была связана с уменьшением выживаемости без заболевания. Мы идентифицировали в общей сложности 6 пациентов из 216 пациентов (2,8%), у которых была выявлена ​​гиперэкспрессия GAD1 рака с z-значением более +2. Пациенты с раком, который сверхэкспрессировал GAD1 , имели среднее время выживания без заболевания 19,8 месяцев по сравнению с 110,3 месяца (p = 0,003) (, рис. 2A, ). У этой группы пациентов был широкий диапазон уровней антигена простаты в сыворотке крови (ПСА) от 3.От 5 до 40,2 мг / дл, степени Глисона от 3 + 3 до 4 + 5 и стадия от T2C до T3B. Хотя на момент операции был только один задокументированный случай метастатической лимфаденопатии, все образцы продемонстрировали экстракапсулярное расширение. Интересно, что снижение экспрессии глутамин синтетазы ( GLUL ), которая потенциально может конкурировать с ферментом GAD1 за глутамат, также было связано со снижением выживаемости без болезней. Всего было идентифицировано 14 пациентов с z-оценкой менее –2, а средняя выживаемость составила 27.9 месяцев против 110,3 месяца (p = 0,006; Рис. 2B ).

Рисунок 2. Экспрессия гена шунта ГАМК при раке человека.

A. Сверхэкспрессия мРНК GAD1 в аденокарциномах простаты коррелирует со снижением выживаемости без заболевания. Опухоли с z-показателем экспрессии GAD1 , превышающим +2, демонстрируют снижение выживаемости без признаков заболевания (в среднем 19,8 месяцев) по сравнению с опухолями, которые не имеют повышенной экспрессии GAD1 (медиана 110,3 месяца; p = 0.002). B. Подавление GLUL при аденокарциномах простаты коррелирует с выживаемостью без признаков заболевания (медиана 27,9 месяца) по сравнению с опухолями без подавления GLUL (медиана 110,3 месяца; p = 0,006). C. Экспрессия мРНК GAD1 в клеточных линиях рака простаты, измеренная с помощью количественной ПЦР. GAD1 Экспрессия обнаруживается в устойчивых к кастрату клеточных линиях NCI-H660, PC3 и DU145, но не в андроген-чувствительных клеточных линиях LNCaP и LAPC4.18S рРНК использовали в качестве внутреннего стандарта. ΔC _t — разность порогового цикла GAD1 и порогового цикла 18S рРНК. Н.Д .: Не обнаружено. D. Сверхэкспрессия мРНК GAD1 в светлоклеточных почечно-клеточных карциномах коррелирует со снижением общей выживаемости. Опухоли с z-оценкой GAD1 > +2 демонстрируют снижение общей выживаемости (медиана 52,5 месяца) по сравнению с опухолями, которые не имеют повышенной экспрессии GAD1 (медиана 80.6 месяцев; р = 0,01). Опухоли с z-оценкой GAD1 > +3 демонстрируют большее снижение средней продолжительности жизни (медиана 31,1 месяца) по сравнению с остальными опухолями (медиана 78,4 месяца; p = 0,002).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088667.g002

Поскольку экспрессия генов NE связана с кастрат-резистентным раком простаты, в частности, в отношении повышенной экспрессии маркера NE декарбоксилазы ароматических аминокислот ( DDC ) при резистентном к кастрату раке простаты [21], мы определили, была ли мРНК GAD1 обогащена при резистентном к кастрату раке простаты человека.Интересно, что экспрессия мРНК GAD1 обнаруживалась только в устойчивых к кастрату клеточных линиях (, рис. 2C, ), с аналогичными уровнями экспрессии в линии раковых клеток NCI-H660 NE и клеточных линиях аденокарциномы PC3 и DU145. Никакой детектируемой экспрессии GAD1 не было идентифицировано ни в одной из андроген-чувствительных клеточных линий LNCaP и LAPC4.

Из-за сообщения об экспрессии белка GAD1 в подмножестве почечно-клеточных карцином [45], мы опросили недавно опубликованное исследование подтипа светлоклеточных почечно-клеточных карцином [40], предоставленное через cBioPortal, чтобы определить, существуют ли аналогичные характеристики выживаемости. .Мы идентифицировали 39 пациентов из 499 пациентов (8%), чьи опухоли сверхэкспрессировали мРНК GAD1 с z-показателем более +2. Эта когорта продемонстрировала значительно сниженную общую выживаемость по сравнению с общей популяцией светлоклеточного рака со средним временем выживания 52,5 месяца по сравнению с 80,6 месяцами (p = 0,01). Затем мы выделили когорту опухолей со сверхэкспрессией GAD1 (n = 18) с z-значением выше +3 и идентифицировали дальнейшее снижение общей выживаемости со средним временем выживания 31.1 месяц по сравнению с 78,4 месяцами (p = 0,002) ( Рис. 2D ). Не было значительного влияния экспрессии мРНК GLUL на выживаемость пациентов в этой популяции.

Разработка анализа

Возможность ГАМК иметь прогностическое значение при выявлении подгрупп онкологических больных с пониженной выживаемостью побудила нас разработать анализ на ГАМК, который мог бы быть широко принят и независим от технически сложных инструментов, таких как масс-спектрометрия и ЯМР.Схема сопряженной реакции, необходимой для количественного определения ГАМК, представлена ​​на рис. 3 . Коммерчески доступный препарат «ГАМКА» из Pseudomonas fluorescens представляет собой комбинацию активности ферментов ABAT и ALDH5A1, которые окисляют ГАМК через серию двух реакций до сукцината, что приводит к восстановлению кофактора НАДФ до НАДФН. Затем НАДФН окисляется до НАДФ митохондриальной диафоразой, таким образом связывая восстановление резазурина с образованием флуоресцентного продукта резоруфина.Хотя ALDH5A1 может использовать как НАД +, так и НАДФ в качестве субстратов, НАДФ традиционно использовался в качестве кофактора с этим препаратом фермента [26].

Рис. 3. Схема флуоресцентного анализа ГАМК.

Препарат GABase, комбинация ферментов ABAT и ALDH5A1 из P. fluorescens превращает GABA в сукцинат посредством превращения альфа-кетоглутарата в глутамат и NADP в NADPH. Хотя НАД или НАДФ потенциально могут использоваться в качестве субстратов для ALDH5A1, НАДФ обычно используется в качестве кофактора для этого препарата.Янтарный полуальдегид (SSAL), промежуточное соединение метаболизма ГАМК, также метаболизируется препаратом ГАМК. Диафораза окисляет НАДФН и восстанавливает резазурин до флуоресцентного резоруфина. Применение 2-аминоэтилгидросульфата (2-AEHS), ингибитора ABAT, можно использовать для определения вклада SSAL в общий сигнал, генерируемый GABA и SSAL в клеточных лизатах.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088667.g003

Оптимизация анализа

Классический анализ активности фермента флуоресценции НАДФН [26] был использован в качестве основы для оптимизации отдельных компонентов считывания ГАМК на основе резазурина.Каждый компонент титровали в диапазоне концентраций, сохраняя все остальные компоненты постоянными (, рис. 4, ). Как и ожидалось, анализ оказался чувствительным к резазурину, продемонстрировав 5,9-кратное увеличение сигнала по сравнению с фоном при концентрации 6,25 мкМ. Что касается ферментных компонентов, наблюдалось 8,6-кратное увеличение сигнала относительно фона при 0,063 единиц / мл ГАМазы и 8,9-кратное увеличение сигнала по сравнению с фоном при 0,063 единиц / мл ферментных препаратов диафоразы. Интересно, что хотя удаление ГАМазы привело к полной потере сигнала по сравнению с фоном, удаление фермента диафоразы из реакционной смеси привело к сигналу все еще 2.В 7 раз выше фона. При дальнейшем анализе было обнаружено, что коммерческий препарат ГАМК содержал НАД (Ф) Н-зависимую резазурин-снижающую активность в отсутствие ГАМК, что могло бы объяснить это открытие (данные не показаны).

Рис. 4. Оптимизационные кривые для анализа, связанного с ГАМ-азой-диафоразой-резазурином.

Каждый компонент реакционной смеси ( A – F ) был титрован для определения оптимальной концентрации для достижения максимального отношения сигнал / фон. Конечная реакционная смесь, основанная на этих кривых, составляла 6.25 мкМ резазурина, 0,063 Ед / мл ГАМазы, 0,063 Ед / мл диафоразы, 100 мкМ НАДФ, 5 мМ альфа-кетоглутарата и 3,125 мкМ DTT. Данные были получены в трех экземплярах.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088667.g004

Была также продемонстрирована важность ферментных кофакторов ( Рис. 4 ). НАДФ, кофактор для компонента ALDH5A1 препарата ГАМазы, добавленный в концентрации 100 мкМ, продемонстрировал значительно увеличенный сигнал, в 9,2 раза по сравнению с фоном.Аналогичным образом, альфа-кетоглутарат, кофактор аминобутираттрансаминазного компонента ГАМазы, продемонстрировал 10,1-кратный сигнал относительно фона при концентрации 5 мМ. Удаление любого из этих кофакторов из реакции привело к полной потере сигнала над фоном.

Дитиотреитол (DTT), восстанавливающий агент, используемый для повышения активности ГАМазы в стандартных анализах флуоресценции НАДФН [26], имел лишь слабый эффект в комбинированном анализе. Сигнал на фоне при отсутствии ДПН составил 7.5-кратный по сравнению с максимумом 8,8-кратного сигнала по сравнению с фоном при концентрации 3,13 мкМ. Концентрации компонентов реакции с наивысшим сигналом над фоном были выбраны для использования в оптимизированной композиции для анализа резазурина для всех будущих экспериментов (, рис. 4, ).

Деконволюция сигнала, полученного от ГАМК и янтарного полуальдегида

Хотя стратегия ГАМазы использовалась при прямом ферментативном определении ГАМК в биологических образцах, механизм, с помощью которого работает этот анализ, также может определять янтарный полуальдегид в образце из-за присутствия двух ферментативных активностей в препарате ГАМазы: аминобутиральдегид трансаминазы ( ABAT), который преобразует ГАМК в янтарный полуальдегид (SSAL) и ALDH5A1, который преобразует SSAL в сукцинат, производя NADPH.Следовательно, сигнал, генерируемый этой реакционной смесью, в принципе может возникать из-за комбинации ГАМК и SSAL в образцах.

Мы продемонстрировали это экспериментально, определив сигнал, генерируемый метаболитами, сходными по структуре с ГАМК, включая SSAL, глутамат, глутамин, сукцинат и бутират. При 25 мкМ ГАМК и SSAL были единственными соединениями, которые продемонстрировали сигнал, значительно отличающийся от фона, что указывает на то, что анализ, связанный с резазурином, был специфичным для ГАМК и SSAL ( рис.5А ).

Рисунок 5. Специфичность анализа ГАМазы.

A. Метаболические стандарты (25 мкМ) добавляли к реакционной смеси и наблюдали кинетику в течение 30 минут. По сравнению с метаболитами, сходными по химической структуре, ГАМК и SSAL являются единственными соединениями, которые генерируют измеримый сигнал в комбинированном анализе. Обратите внимание на разрыв шкалы, чтобы визуализировать остаточную деятельность. ND: Сигнал поверх фона не обнаружен. Сигнал флуоресценции измеряется в произвольных единицах (A.U.) и корректируется по холостому образцу. B. Кривая ингибирования 2-аминоэтилгидросульфата, ингибитора компонента ГАМК трансаминазы (ABAT) препарата ГАМазы. При концентрациях, равных или превышающих 25 мМ, сигнал резоруфина от ГАМК полностью отменяется, позволяя НАДФН (следовательно, сигнал резоруфина), продуцируемый компонентом янтарной альдегиддегидрогеназы (ALDH5A1) препарата ГАМК, быть специфичным для янтарного полуальдегида (SSAL). . Данные были получены в трех экземплярах и нормализованы по сигналу в отсутствие ингибитора.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088667.g005

Чтобы обойти эту потенциальную проблему двойной специфичности, мы использовали недорогой ингибитор ABAT, 2-аминоэтилгидросульфат (этаноламин-O-сульфат) [46 ], [47]. Таким образом, добавление этого ингибитора к препарату основной смеси будет ингибировать активность ABAT в препарате GABase, что позволяет проводить специфическое количественное определение SSAL в образце. Кроме того, вычитание сигнала, полученного в присутствии ингибитора, из сигнала, полученного без ингибитора, привело бы к GABA-специфическому сигналу.Эта методология ранее применялась к ферментативному анализу на ГАМК и SSAL, в котором используется менее чувствительный метод флуоресценции NAD (P) H [48].

Как и ожидалось, мы наблюдали зависящий от концентрации эффект 2-аминоэтилгидросульфата на сигнал, полученный от 100 мкМ ГАМК ( Фиг. 5B ). Измеряемый сигнал ГАМК наблюдался до 25 мМ. По этой причине мы использовали 2-аминоэтилгидросульфат в концентрации 50 мМ, когда это необходимо для придания специфичности в последующих экспериментах.

Механика парного анализа

Кинетику образования резоруфина анализировали в присутствии 25 мкМ ГАМК и 25 мкМ SSAL ( Фиг. 6A ). Образование резоруфина было линейным во времени в течение 30 минут с последующим асимптотическим поведением в течение 120 минут. Поэтому была выбрана 30-минутная временная точка, чтобы генерировать максимальный сигнал в пределах области линейности для всех дополнительных экспериментов. Стандарты ГАМК или SSAL (10 мкл) добавляли к реакционной смеси (90 мкл).Сигнал, генерируемый резоруфином, был линейным для 100 мкМ ГАМК или SSAL со значением R ² , равным 0,997 для ГАМК и 0,992 для SSAL ( Фиг. 6B ). Расчет «Z-фактора», показателя устойчивости анализа [49], показал значение 0,8 для ГАМК и 0,9 для SSAL, что указывает на надежность анализа для обоих метаболитов.

Рисунок 6. Механика анализа ГАМазы.

A. Типичная кинетика для анализа связанной ГАМазы с использованием 25 мкМ ГАМК. Кинетика плато видна через 30 минут.Кинетическая кривая представляет собой среднее значение трех измерений. B. Линейность анализа. Стандарты ГАМК и SSAL (10 мкл) в указанных концентрациях добавляли к реакционной смеси (90 мкл) и измеряли через 30 минут. Предел обнаружения для анализа составил 0,78 мкМ ГАМК и 0,41 мкМ SSAL. Предел количественного определения составлял 2,6 мкМ ГАМК и 1,4 мкМ SSAL. Фактор Z ’для анализа составлял 0,8 для ГАМК и 0,9 для SSAL. C. Стандартная кривая [ГАМК] с использованием стандартного анализа флуоресценции NADPH.Этот анализ продемонстрировал более низкую чувствительность, чем анализ связанного резазурина, когда его проводили в оптимальных условиях на оптической пластине. Предел обнаружения для анализа составил 67 мкМ. Предел количественного определения для анализа составлял 223 мкМ. Коэффициент Z ’для анализа составлял 0,9. Сигнал флуоресценции измеряется в произвольных единицах (A.U.) и корректируется по холостому образцу. Данные были получены в трех экземплярах.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088667.g006

Предел количественного определения (LOQ) и предел обнаружения (LOD) рассчитывались, как описано ранее [50].Предел обнаружения определяется как 3σ / S, а предел количественного определения определяется как 10σ / S, где σ — стандартное отклонение фона, а S — наклон стандартной кривой. Используя эти уравнения применительно к нашему комбинированному анализу, предел обнаружения ГАМК и SSAL составлял 0,78 мкМ и 0,41 мкМ, соответственно, а предел количественного определения составлял 2,6 мкМ и 1,4 мкМ, соответственно. Для справки: анализ флуоресценции НАДФН для ГАМК был гораздо менее чувствительным, обнаруживая предел обнаружения 67 мкМ и предел количественного определения 223 мкМ ( рис.6С ).

Оптимизация подготовки проб

Мы стремились разработать эффективный протокол подготовки образцов, который эффективно лизировал ткань, мог бы проводиться в формате микропланшета, не разрушал ГАМК и SSAL и был совместим с ферментативным анализом. Мы изменили ранее опубликованный протокол [25], [26], в котором использовался гидроксид натрия для лизирования ткани с последующим добавлением избытка соляной кислоты и нагреванием при 60 ° C в течение 30 минут для разрушения эндогенного NAD (P) H и ферментативной активности. это может помешать анализу с последующей нейтрализацией основанием Трис.

Чтобы определить, был ли этот метод подготовки образца совместим с количественным определением ГАМК и SSAL, мы применили известную концентрацию ГАМК или SSAL (конечная концентрация 25 мкМ) к аликвоте лизированных клеток LNCaP, клеточной линии аденокарциномы простаты человека, содержащей низкий уровень ГАМК-шунта. активность [25]. Используя лизированные клетки LNCaP без экзогенного применения ГАМК или SSAL в качестве компараторов, разницу в сигнале ГАМК, полученном от двух групп образцов LNCaP, сравнивали со стандартами 25 мкМ ГАМК или SSAL, приготовленными в воде, и стандартами 25 мкМ ГАМК или SSAL, подвергнутыми методу подготовки образца. .Мы количественно извлекли стандарты ГАМК и SSAL из тканевого лизата и продемонстрировали, что метод подготовки образцов не повлиял на ГАМК и SSAL. ( Рис.7 ).

Рис. 7. Влияние пробоподготовки на стабильность и восстановление ГАМК и SSAL.

25 мкМ стандарта ГАМК или SSAL обрабатывали протоколом подготовки образца, состоящим из 50 мМ гидроксида натрия, с последующим нагреванием при 60 ° C в течение 40 минут с избытком 50 мМ HCl и затем нейтрализацией 400 мМ трис-основания.Не было существенной разницы в сигнале, полученном от стандарта 25 мкМ ГАМК или SSAL по сравнению с 25 мкМ ГАМК или SSAL, обработанных с помощью техники подготовки образца. Для тестирования выделения GABA и SSAL из ткани к образцу клеток рака простаты LNCaP добавляли стандарт GABA или SSAL в конечной концентрации 25 мкМ и подвергали протоколу подготовки образца. Сигнал, полученный из образца, вычитали из сигнала, полученного из идентичного образца ткани без добавления стандарта, демонстрируя количественное извлечение ГАМК и SSAL из тканей с использованием этого метода.Был измерен сигнал флуоресценции, и все данные нормализованы по необработанным стандартам. Данные были получены в трех экземплярах.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088667.g007

Ограничения анализа

Некоторые биологически релевантные молекулы могут ингибировать анализ. Кобальт, обычно используемый для фармакологического моделирования гипоксии [51], [52], может ингибировать диафоразу [53]. Цинк является потенциально важным металлом в биологии нейронов, поскольку синаптический цинк может регулировать возбудимость нейронов и модулировать рецепторы ГАМК [54] — [56].Оба металла показали ингибирующее действие на анализ, но только при высоких концентрациях в образце, с приблизительным значением IC ₅₀ , равным 1000 мкМ для кобальта и 400 мкМ для цинка. Окислительное повреждение от перекиси водорода может ингибировать NADH-продуцирующие ферменты цикла трикарбоновых кислот (TCA) [57], предполагая, что перекись может ингибировать продукцию NADH в связанном анализе. Однако наблюдался только слабый эффект перекиси с ингибированием примерно 30% при концентрации в образце 1 мМ ( рис.8А ).

Рисунок 8. Ограничения анализа ГАМазы.

A. Ингибиторы анализа ГАМазы. Было проведено титрование потенциальных ингибиторов анализа ГАМазы, и сигнал был измерен через 30 минут. Анализ продемонстрировал ингибирование тяжелыми металлами кобальтом (IC ₅₀ = 1 мМ) и цинком (IC ₅₀ = 400 мкм) при высоких концентрациях. При высоких концентрациях образца (1 мМ) перекись водорода слабо ингибируется. Данные были получены в трех экземплярах. B. Кинетика разложения реакционной смеси. После приготовления полной реакционной смеси смесь хранили в темноте при 4 ° C или 25 ° C. По истечении указанного времени в реакционную смесь добавляли фиксированную концентрацию стандарта ГАМК. Сигнал, полученный в разные моменты времени, был нормализован к сигналу, полученному в нулевой момент времени. Данные были получены в трех экземплярах.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088667.g008

Учитывая присутствие лабильных компонентов в реакционной смеси, мы исследовали стабильность реакционной смеси при двух температурах: 4 ° C и комнатной температуре (RT ) в течение 24 часов.Реакционная смесь была более стабильной при хранении при 4 ° C по сравнению с RT, но все еще разлагалась с течением времени, сохраняя только 66% своей активности через 6 часов и демонстрируя полную потерю активности через 24 часа после приготовления ( Рис. 8B ) . По этой причине перед каждым анализом готовили свежую реакционную смесь.

Валидация анализа

Корреляция между сверхэкспрессией мРНК GAD1 и снижением выживаемости без признаков заболевания при аденокарциноме простаты и общей выживаемостью при светлоклеточной почечно-клеточной карциноме побудила нас изучить потенциальную роль GAD1 в метаболизме NE.Хотя ранее это не было зарегистрировано при раке, активность GAD увеличивается у других организмов, таких как растения и бактерии, в ответ на биотические и абиотические стрессоры [58], такие как кислотность. Кроме того, оценка пути шунтирования ГАМК демонстрирует, что глутамат, субстрат для GAD1, может происходить из альфа-кетоглутарата из цикла TCA или, альтернативно, из глутамина. Это предполагает, что нарушения внеклеточной среды, в частности, изменение pH и недостаток питательных веществ, могут модулировать концентрацию ГАМК в раковых клетках.

Высокая концентрация ГАМК в клетках PNEC в сочетании с предыдущими данными о том, что компоненты шунта GABA, в частности GAD1, обогащены клетками PNEC по сравнению с другими клетками аденокарциномы простаты [25], побудили нас использовать эту клеточную линию для исследования модуляции, вызванной стрессом окружающей среды. ГАМК.

Сначала мы количественно измерили ГАМК в клеточной линии PNEC после 24 часов депривации глюкозы или глутамина. По сравнению с контролем (т.е. обычной средой с диализованной сывороткой) не было статистически значимой разницы в количестве ГАМК в лишенных глюкозы клетках PNEC (1137 против 1182 пмоль ГАМК / мкг белка, соответственно).Однако депривация глутамина значительно снизила клеточную ГАМК (390 пмоль ГАМК / мкг клеточного белка) по сравнению с контролем. Интересно, что эти стрессы относительно не влияли на уровни SSAL, за исключением депривации глюкозы. Депривация глюкозы вызывала незначительное увеличение SSAL (21,3 пмоль SSAL / мкг белка) по сравнению с контролем (16,7 пмоль SSAL / мкг белка), только достигая статистической значимости (p <0,05) (, рис. 9 ).

Рисунок 9. Количественное определение ГАМК, SSAL и глутамата в клетках PNEC после 24 часов pH-стресса и лишения питательных веществ.

Эффекты 24-часовой депривации глюкозы и глутамина на A. GABA, B. SSAL и C. Измеряли уровни глутамата в клетках PNEC. Эксперименты по лишению питательных веществ проводили в среде DMEM / F12 с дефицитом субстрата, содержащей диализованную эмбриональную телячью сыворотку с добавлением 6 мМ глутамина и / или 17,5 мМ глюкозы в течение 24 часов. Влияние 24-часового pH-стресса при pH 6,5 и 8,5 относительно физиологического pH 7,4 на D. GABA, E. SSAL и F.Было измерено уровней глутамата в клетках PNEC. Уровни метаболитов в клеточных лизатах анализировали и нормализовали по общему клеточному белку. * Достоверность относительно контроля (p <0,05). Данные представляют собой четырехкратные измерения.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088667.g009

Помимо количественного определения ГАМК и его последующего метаболита SSAL при стрессах, мы также измеряли предшествующий метаболит, глутамат, в клетках PNEC при тех же стрессах. .Мы использовали опубликованный ферментативный анализ на основе резазурина для обнаружения глутамата [41], чтобы определить уровни глутамата в стрессированных клетках PNEC. Интересно, что по сравнению с контролем уровни глутамата были значительно снижены при депривации глюкозы (316 против 209 пмоль / мкг белка, соответственно) и наиболее выражены при депривации глутамина (71 пмоль / мкг белка) ( рис. 9 ).

Ферменты внутри шунта ГАМК имеют разные оптимумы pH [26]. Например, GAD1 млекопитающих имеет оптимальный диапазон pH 6-7, а ABAT и ALDH5A1 млекопитающих имеют оптимальный диапазон pH 8-9.Это предполагает, что кислые условия будут способствовать синтезу ГАМК и, наоборот, щелочные условия будут способствовать метаболизму ГАМК. После 24 часов воздействия pH окружающей среды 6,5 содержание ГАМК в клетках PNEC было значительно повышено по сравнению с pH 7,5 (1142 против 870 пмоль / мкг белка). Напротив, содержание ГАМК было значительно снижено в клетках PNEC, подвергнутых воздействию pH 8,5 (521 пмоль / мкг белка) (, фиг. 9, ). Несмотря на эти изменения в ГАМК, не было статистически разных изменений уровней SSAL по сравнению с контролем ( рис.9 ).

глутамата в клетках PNEC при pH-стрессе. Хотя не было значительной разницы в количестве глутамата в клетках PNEC при pH 6,5 по сравнению с pH 7,5 (158 против 193 пмоль / мкг белка, соответственно), было значительно повышено количество глутамата при pH 8,5 (458 пмоль / мкг белка) ( рис. 9 ).

Чтобы объяснить эти изменения метаболитов клеток PNEC, мы исследовали ферментативную активность трех ключевых компонентов, участвующих в метаболизме глутамата, ГАМК и SSAL.Помимо модификации нашего нового анализа для измерения ГАМК, продуцируемого активностью GAD, мы также использовали обычные ферментативные анализы для GLUL и ALDH5A1.

Не было значительных различий в активности GAD после депривации глюкозы или глутамина ( рис. 10 ) . Следует отметить, что наблюдалась тенденция к увеличению активности GAD, которая могла коррелировать со значительно повышенными уровнями SSAL после депривации глюкозы (188,4 против 142,5 пмоль ГАМК / час / мкг белка).Активность ALDH5A1, аналогичным образом, не продемонстрировала каких-либо существенных различий в активности. Однако наиболее заметные различия наблюдались в активности GLUL. Интересно, что депривация глюкозы значительно увеличивала активность GLUL (20,27 против 9,88 пмоль γ-глутамилгидроксамата / час / мкг белка). Депривация глутамина, как и ожидалось, привела к наиболее резкому увеличению активности GLUL (47,5 пмоль γ-глутамилгидроксамата / час / мкг белка). Затем мы оценили уровни экспрессии белков этих ферментов, чтобы коррелировать с их активностью.Никаких определенных изменений в экспрессии не наблюдалось для GAD1 или ALDH5A1. Однако экспрессия GLUL увеличивалась как при депривации глюкозы, так и глутамина (, фиг. 10D, ).

Рисунок 10. Измерения активности ферментов GAD1, GLUL и ALDH5A1 в клетках PNEC после лишения питательных веществ.

Эффекты 24-часовой депривации глюкозы и глутамина на A. GAD1, B. GLUL и C. Измеряли уровни ALDH5A1 в клетках PNEC. D. Белковая экспрессия ферментов коррелирует с ферментативной активностью.Бета-актин (ACTB) используется для контроля нагрузки. Эксперименты по лишению питательных веществ проводили, как описано выше. Активность ферментов в клеточных лизатах анализировали и нормализовали по времени реакции и общему клеточному белку. * Достоверность относительно контроля (p <0,05). Данные представляют собой четырехкратные измерения.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088667.g010

Влияние pH на активность GAD было более выраженным. Интересно, что кислый pH значительно увеличивал активность GAD (344 против 272 пмоль ГАМК / час / мкг белка).Напротив, щелочной pH значительно снижает активность GAD по сравнению с физиологическим pH (185 пмоль ГАМК / час / мкг белка). Однако влияние pH на активность GLUL было другим. Хотя кислый pH увеличивал активность GLUL (16,93 против 8,15 пмоль γ-глутамилгидроксамата / час / мкг белка), щелочной pH также увеличивал активность GLUL (11,74 пмоль γ-глутамилгидроксамата / час / мкг белка). Влияние pH на активность ALDH5A1 было совершенно различным, со статистически неизменной активностью при кислых и физиологических pH (2.72 против 2,66 нмоль НАДН / час / мкг белка), а также щелочной pH (2,36 нмоль НАДН / час / мкг белка). При этом экспрессия белка коррелировала с активностью фермента. Экспрессия GAD1 повышалась при кислом pH и снижалась при щелочном pH, экспрессия GLUL увеличивалась как при кислом, так и при щелочном pH, а ALDH5A1 не изменялся (, фиг. 11, ).

Рисунок 11. Измерения активности ферментов GAD1, GLUL и ALDH5A1 в клетках PNEC после pH-стресса.

Влияние 24-часового кислотного и щелочного стресса на А. GAD1, B. GLUL и C. Измеряли уровни ALDH5A1 в клетках PNEC. D. Белковая экспрессия ферментов коррелирует с ферментативной активностью. Бета-актин (ACTB) используется для контроля нагрузки. Активность ферментов в клеточных лизатах анализировали и нормализовали по времени реакции и общему клеточному белку. * Достоверность относительно контроля (p <0,05). Данные представляют собой четырехкратные измерения.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088667.g011

Обсуждение

Используя ранее опубликованные наборы данных, характеризующие экспрессию генов при раке простаты и почек [39], [40], было выявлено потенциально вредное влияние сверхэкспрессии GAD1 и недостаточной экспрессии GLUL на выживаемость пациентов.Оба фермента используют глутамат и поэтому конкурируют за один и тот же субстрат, что предполагает наличие метаболического антагонизма, при котором преобразование глутамата в ГАМК по сравнению с глутамином предпочтительнее в контексте рака, связанного с более плохими исходами. Кроме того, была обнаружена уникальная сверхэкспрессия мРНК GAD1 в избранной когорте линий клеток кастрат-устойчивого рака простаты. Тем не менее, клиническое значение GAD1 при кастрат-резистентном раке простаты еще предстоит выяснить, поскольку количество рака простаты с избыточной экспрессией GAD1, идентифицированное в общедоступных базах данных, было небольшим и не могло быть точно коррелировано с кастрат-резистентным заболеванием.Тем не менее, повышенная экспрессия белка фермента NE, допа-декарбоксилазы (DDC; E.C. 4.1.1.28) коррелирует с кастрат-резистентным заболеванием [21], дополнительно поддерживая программу NE, связанную с кастрат-резистентным раком простаты. Эти анализы необходимо распространить на более широкие группы пациентов и дополнительно оценить с помощью строгих иммуногистохимических и метаболомических методов для дальнейшего определения прогностической значимости GAD1 и связанных с ним компонентов пути для выживаемости пациентов и рецидивов заболевания.Наши результаты дополнительно подтверждаются исследованиями, подтверждающими пролиферативное действие ГАМК на раковые клетки, экспрессию GAD1 и экспрессию рецепторов ГАМК при множественных раковых заболеваниях по всему телу [59] — [62].

Шунт ГАМК сохраняется у прокариот и эукариот и активируется в контексте множественных стрессов. Например, декарбоксилаза глутаминовой кислоты широко участвует в выживании прокариот и растений в кислой среде [58], [63] — [67]. Однако механизмы, с помощью которых декарбоксилаза глутаминовой кислоты позволяет организмам пережить кислотный стресс, остаются неясными.Очевидная роль шунта ГАМК в уклонении от стрессов окружающей среды, способствующих выживанию других организмов, интригует, поскольку такие стрессы также важны в микросреде раковых клеток и, следовательно, могут быть вовлечены в способность раковых клеток выживать в условиях стресса.

Было проведено множество исследований влияния микросреды рака на физиологию опухоли. Например, было продемонстрировано, что кислотность вызывает метастазирование [68], в то время как подщелачивание микроокружения опухоли бикарбонатом натрия уменьшает метастазирование [69] — [71].Наши результаты предполагают взаимодействие между микросредой рака, метаболизмом рака и метастатическим потенциалом раковых клеток. Ранее было документально подтверждено, что GAD1-опосредованный синтез GABA и передача сигналов через рецепторы GABA-B способствуют экспрессии матриксных металлопротеиназ и инвазии клеток рака простаты [72]. Мы предполагаем, что активность шунта ГАМК, по крайней мере, в клетках рака простаты, может представлять собой метаболический путь, посредством которого микросреда может стимулировать метастазирование, а также может представлять собой механизм, посредством которого терапия бикарбонатом снижает метастазирование.

Здесь мы продемонстрировали, что изменения внеклеточного pH могут модулировать уровни глутамата и GABA шунтирующих метаболитов GABA посредством модуляции экспрессии и активности ферментов GAD1 и GLUL. В кислых условиях белок GAD1 и его активность увеличиваются в клетках PNEC, что коррелирует с увеличением концентрации ГАМК. Интересно, что уровни и активность белка GLUL также увеличиваются при кислом pH. Несмотря на повышенную активность обоих этих ферментов, участвующих в метаболизме глутамата, нет статистически значимых различий в концентрации глутамата при кислом pH.Эти результаты могут представлять собой сложное проявление метаболического потока через дополнительные метаболические пути, а также пути синтеза белка, в которых участвует глутамат.

Влияние щелочности на шунт ГАМК столь же интригующе. Воздействие щелочного pH 8,5 встречает снижение активности GAD1, а также уменьшение ГАМК и увеличение концентрации глутамата. Хотя эти изменения в концентрации метаболитов ожидаются из-за снижения активности GAD1, наблюдается также увеличение активности GLUL при щелочном pH.Следует отметить, что уровни белка GLUL при щелочном pH были выше по сравнению с кислым pH, несмотря на аналогичную ферментативную активность. Это могло быть связано с присутствием эндогенных ферментных ингибиторов в сложном клеточном лизате или могло отражать метаболическую изменчивость между пассажами в клеточной культуре, хотя все клетки, использованные в этом исследовании, имели низкое количество культур. В настоящее время неясно, является ли механизм, лежащий в основе активации GLUL или его прогнозируемого увеличения концентрации глутамина при щелочном pH, таким же, как и при кислом pH.Значительное увеличение концентрации глутамата при щелочном, но не кислом pH еще больше подчеркивает возможность сложных метаболических потоков глутамата, глутамина и ГАМК во время pH-стресса. На данный момент мы предполагаем, что снижение ГАМК при щелочном pH может быть связано с комбинацией субстратной конкуренции из-за увеличения GLUL, а также со снижением активности GAD1.

Механизм, лежащий в основе относительно стабильной экспрессии ALDH5A1 при кислотном и щелочном стрессе, а также его известная регуляция клеточным окислительно-восстановительным состоянием [73] предполагает, что метаболизм ГАМК в сукцинат может быть более зависимым от посттрансляционной регуляции, чем от экспрессии генов.Хотя активность ALDH5A1 оптимальна при pH 8–9 [26], не было доказательств существенных различий в изменениях активности ферментов в лизатах клеток PNEC. Хотя такие факторы, как внеклеточный pH, pCO ₂ , бикарбонат и лактат могут напрямую влиять на внутриклеточный pH [74], [75], в настоящее время неясно, напрямую ли модулируется активность ALDH5A1 изменениями внутриклеточного pH. Кроме того, еще предстоит выяснить роль ABAT в метаболизме ГАМК. Неизмененная концентрация SSAL при pH-стрессе также может отражать эффект сложных метаболических потоков, в частности, от углерода через плечо цикла мочевины шунта ГАМК [13].

Относительный вклад глюкозы и глутамина в синтез ГАМК в раковых клетках изучен не полностью. Однако общий вклад глюкозы и глутамина в метаболизм раковых клеток широко задокументирован [76]. Следует отметить, что глутамин является альтернативным глюкозе субстратом для синтеза нуклеотидов и липидов и источником АТФ [77], [78]. Кроме того, вклад метаболизма глутамина в выживаемость раковых клеток при стрессе был в некоторой степени изучен с доказательствами того, что выживаемость раковых клеток при гипоксии может зависеть от глутамина и метаболизма глутамата [79].Несмотря на отсутствие значительных изменений в экспрессии или активности GAD1 после депривации глутамина, мы идентифицировали снижение глутамата и ГАМК, коррелирующее с повышенной активностью GLUL, как потенциальный механизм увеличения клеточных запасов глутамина. Это также подтверждает потенциальный метаболический антагонизм между GLUL и GAD1, который мы также идентифицировали в щелочных условиях и предположили на основе анализа выживаемости. Тенденция к снижению активности SSAL и ALDH5A1 после депривации глутамина предполагает снижение потока через шунт GABA в результате депривации глутамина.Эти данные служат дополнительным аргументом в пользу депривации глутамина в качестве противоопухолевой терапии для снижения синтеза ГАМК.

Хотя депривация глюкозы не привела к значительным изменениям в экспрессии или активности GAD1, также существовала потенциальная тенденция к увеличению активности GAD1, а также к значительному увеличению SSAL, предполагая, что поток через шунт GABA сохраняется или потенциально увеличивается во время депривации глюкозы. Следует отметить, что наши эксперименты по депривации глюкозы проводились в отсутствие экзогенного пирувата, который потенциально мог действовать как источники углерода для цикла TCA.Возможно, что шунт ГАМК при депривации глюкозы может представлять собой механизм производства NADH за счет активности ALDH5A1 и поставки углерода в цикл TCA, предположительно через глутамин и, возможно, цикл мочевины, хотя это еще предстоит продемонстрировать с более сложным метаболическим потоком. анализ. Повышенная активность GLUL при депривации глюкозы, вероятно, является проявлением истощенных запасов глутамина в средах для культивирования клеток (используемых в этих экспериментах в концентрации 6 мМ), что дополнительно подтверждает потребность в глутамине в качестве источника углерода для клеток в отсутствие глюкозы.

Таким образом, мы описали новый флуорометрический анализ, который дал первое представление о том, как pH и стресс из-за питательных веществ модулируют ГАМК в клетках NE рака простаты. Это представляет собой новый регуляторный механизм, с помощью которого раковые клетки могут реагировать на стрессы окружающей среды. Этот анализ можно широко адаптировать к одному микропланшету или форматам с высокой пропускной способностью для измерения содержания ГАМК в нескольких образцах при различных условиях, обработках или временных точках.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Джейн Мараса из ядра High Throughput Screening (HTS) за ее помощь.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: JI. Проведены эксперименты: JI. Проанализированы данные: JI. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: JI DPW. Написал статью: JI DPW.

Ссылки

1. 1. Делеллис Р.А. (2001) Нейроэндокринная система и ее опухоли: обзор. Am J Clin Pathol 115 Suppl: S5–16.
2. 2. Wick MR (2000) Нейроэндокринная неоплазия. Текущие концепции. Am J Clin Pathol 113: 331–335.
3. 3. Wick MR, Ritter JH (2002) Нейроэндокринные новообразования: развивающиеся концепции и терминология. Curr Diag Pathol 8: 102–112.
4. 4. Бабин Э., Руло В., Ведрин П.О., Туссент Б., де Раукур Д. и др. (2006) Мелкоклеточная нейроэндокринная карцинома полости носа и придаточных пазух носа. Дж. Ларингол Отол 120: 289–297.
5. 5. Demellawy DE, Samkari A, Sur M, Denardi F, Alowami S (2006) Первичная мелкоклеточная карцинома слепой кишки. Энн Диаг Патол 10: 162–165.
6. 6. Montie JE (2006) Мелкоклеточная карцинома мочевого пузыря: одноцентровое проспективное исследование 25 случаев лечения по аналогии с мелкоклеточным раком легкого. Дж. Урол 175: 2070–2071.
7. 7. Соренсен М., Лассен У., Хансен Х.Х. (1998) Текущая терапия мелкоклеточного рака легкого. Curr Opin Oncol 10: 133–138.
8. 8. Цунода С., Джобо Т., Араи М., Имаи М., Канаи Т. и др. (2005) Мелкоклеточный рак шейки матки: клинико-патологическое исследование 11 случаев.Int J Gynecol Cancer 15: 295–300.
9. 9. Яо Дж. Л., Мадеб Р., Борн П., Лей Дж., Ян Х и др. (2006) Мелкоклеточная карцинома простаты: иммуногистохимическое исследование. Am J Surg Pathol 30: 705–712.
10. 10. Джекман Д.М., Джонсон Б.Е. (2005) Мелкоклеточный рак легкого. Ланцет 366: 1385–1396.
11. 11. Сигел Р., Найшадхам Д., Джемал А. (2012) Статистика рака, 2012. CA Cancer J Clin 62: 10–29.
12. 12. Бхаттачарджи А., Ричардс В.Г., Стонтон Дж., Ли К., Монти С. и др.(2001) Классификация рака легких человека по профилю экспрессии мРНК выявляет различные подклассы аденокарцином. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 13790–13795.
13. 13. Ippolito JE, Xu J, Jain S, Moulder K, Mennerick S и др. (2005) Комплексный подход к функциональной геномике и метаболомике для определения плохого прогноза нейроэндокринного рака человека. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 9901–9906.
14. 14. Abrahamsson PA (1999) Нейроэндокринная дифференциация при карциноме предстательной железы.Простата 39: 135–148.
15. 15. Синдзи С., Наито З., Исивата Т., Танака Н., Фурукава К. и др. (2006) Дифференцировка нейроэндокринных клеток низкодифференцированной колоректальной аденокарциномы коррелирует с метастазированием в печень. Int J Oncol 29: 357–364.
16. 16. Беррути А., Моска А., Туччи М., Терроне С., Торта М. и др. (2005) Независимая прогностическая роль циркулирующего хромогранина А у пациентов с раком простаты и гормонорезистентным заболеванием. Endocr Relat Cancer 12: 109–117.
17. 17. Cheville JC, Tindall D, Boelter C, Jenkins R, Lohse CM и др. (2002) Метастатическая карцинома простаты в кость: клинические и патологические особенности, связанные с выживаемостью при раке. Рак 95: 1028–1036.
18. 18. Quek ML, Daneshmand S, Rodrigo S, Cai J, Dorff TB и др. (2006) Прогностическое значение нейроэндокринной экспрессии при раке предстательной железы с положительным лимфоузлом. Урология 67: 1247–1252.
19. 19. di Sant’Agnese PA, Cockett AT (1996) Нейроэндокринная дифференциация при злокачественных новообразованиях предстательной железы.Рак 78: 357–361.
20. 20. Abrahamsson PA (1999) Нейроэндокринные клетки в опухолевом росте простаты. Endocr Relat Cancer 6: 503–519.
21. 21. Вафа Л.А., Палмер Дж., Фазли Л., Уртадо-Колл А., Белл Р. Х. и др. (2007) Всесторонний анализ экспрессии L-допа декарбоксилазы и установленных нейроэндокринных маркеров при лечении неоадъювантными гормонами по сравнению с опухолями предстательной железы различной степени злокачественности по Глисону. Хум Патол 38: 161–170.
22. 22. di Sant’Agnese PA (1992) Нейроэндокринная дифференцировка при раке предстательной железы человека.Хум Патол 23: 287–296.
23. 23. Гарабедян Е.М., Хамфри П.А., Гордон Дж. И. (1998) Модель трансгенных мышей метастатического рака простаты, происходящего из нейроэндокринных клеток. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 15382–15387.
24. 24. Hu Y, Ippolito JE, Garabedian EM, Humphrey PA, Gordon JI (2002) Молекулярная характеристика метастатического нейроэндокринно-клеточного рака, возникающего в предстательной железе трансгенных мышей. Дж. Биол. Хим. 11: 11.
25. 25. Ippolito JE, Merritt ME, Backhed F, Moulder KL, Mennerick S и др.(2006) Связь между клеточными коммуникациями, использованием энергии и пролиферацией при метастатическом нейроэндокринном раке. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 12505–12510.
26. 26. СП Пассоно и Лоури О. (1993) Энзиматический анализ: Практическое руководство Тотова, Нью-Джерси: Humana Press.
27. 27. Такаяма Н., Охара Т., Ямамото Н. (2012) Ферментативный флуорометрический микропланшетный анализ для количественного анализа 3-гидроксимасляной кислоты в плазме мышей. Анальная биохимия 425: 114–116.
28. 28. Vermeir S, Nicolai BM, Jans K, Maes G, Lammertyn J (2007) Высокопроизводительные ферментативные анализы на микропланшетах для быстрого количественного определения сахара и кислоты в яблоках и помидорах. J. Agric Food Chem., 55: 3240–3248.
29. 29. Hausler RE, Fischer KL, Flugge UI (2000) Определение метаболитов с низким содержанием в растительных экстрактах по флуоресценции NAD (P) H с помощью считывающего устройства для микротитровальных планшетов. Анальный Биохим 281: 1–8.
30. 30. Валеро Э., Варон Р., Гарсия-Кармона Ф. (2004) Кинетический анализ модели двойного цикла субстрата: количественное определение высокоамплифицированного АДФ (и / или АТФ).Biophys J 86: 3598–3606.
31. 31. Zhu CT, Rand DM (2012) Циклический анализ, связанный с гидразином, подтверждает снижение окислительно-восстановительного отношения при голодании у дрозофилы. PLoS One 7: e47584.
32. 32. Xue Q, Wang L, Jiang W (2013) Новая стратегия каскадной амплификации без метки, основанная на опосредованном гантель-зондом образовании G-квадруплекса, чувствительного к амплификации по вращающемуся кругу, для высокочувствительного и селективного обнаружения NAD + или ATP. Chem Commun (Camb) 49: 2640–2642.
33. 33. Yamamoto N, Sato T, Kawasaki K, Murosaki S, Yamamoto Y (2006) Нерадиоизотопный ферментативный анализ поглощения 2-дезоксиглюкозы в клетках скелетных мышц L6, культивируемых в 96-луночном микропланшете. Анальная биохимия 351: 139–145.
34. 34. Чжу А., Ромеро Р., Петти Х. Р. (2009) Ферментативный флуориметрический анализ глюкозо-6-фосфата: применение в лабораторных условиях эффекта Варбурга. Анальная биохимия 388: 97–101.
35. 35. Hu Y, Wang T, Stormo GD, Gordon JI (2004) РНК-интерференция гомолога 1 achaete-scute в нейроэндокринных клетках простаты мышей выявляет его генные мишени и сайты связывания ДНК.Proc Natl Acad Sci U S A 101: 5559–5564.
36. 36. Бакак М., Проверо П., Майран Н., Стеле Дж. К., Фуско С. и др. (2006) Реакция стромы мыши на инвазию опухоли предсказывает выживаемость пациентов с раком простаты и молочной железы. PLoS One 1: e32.
37. 37. Cerami E, Gao J, Dogrusoz U, Gross BE, Sumer SO и др. (2012) Портал геномики рака cBio: открытая платформа для изучения многомерных данных геномики рака. Рак Discov 2: 401–404.
38. 38. Гао Дж., Аксой Б.А., Догрузоз У., Дрезднер Дж., Гросс Б. и др.(2013) Интегративный анализ сложной геномики рака и клинических профилей с использованием cBioPortal. Научный сигнал 6: pl1.
39. 39. Тейлор Б.С., Шульц Н., Иеронимус Х., Гопалан А., Сяо Ю. и др. (2010) Интегративное геномное профилирование рака простаты человека. Раковая клетка 18: 11–22.
40. 40. Сеть CGAR (2013) Всесторонняя молекулярная характеристика светлоклеточного почечно-клеточного рака. Природа 499: 43–49.
41. 41. Chapman J, Zhou M (1999) Флуорометрические методы на основе микропланшетов для ферментативного определения l-глутамата: применение для измерения l-глутамата в образцах пищевых продуктов.Анальный Чим Acta 402: 47–52.
42. 42. Wolf R, Klemisch H (1991) Адаптация ферментативного флуоресцентного анализа для декарбоксилазы L-глутаминовой кислоты. Анальная биохимия 192: 78–81.
43. 43. Miller RE, Hackenberg R, Gershman H (1978) Регулирование глутаминсинтетазы в культивируемых клетках 3T3-L1 с помощью инсулина, гидрокортизона и дибутирилциклического АМФ. Proc Natl Acad Sci U S A 75: 1418–1422.
44. 44. Pusateri ME, Carter JG, Berger SJ, Lowry OH (1984) Распределение трех ферментов метаболизма гамма-аминомасляной кислоты в сетчатке обезьяны.Журнал Neurochem 42: 1269–1272.
45. 45. Марин-Валенсия I, Чо С.К., Ракхеджа Д., Хатанпаа К.Дж., Капур П.и др. (2012) Метаболизм глюкозы через пентозофосфатный путь, гликолиз и цикл Кребса в ортотопической модели опухолей головного мозга у мышей. ЯМР Биомед 25: 1177–1186.
46. 46. Kwan YW, Ngan MP, Tsang KY, Lee HM, Chu LA (1996) Пресинаптическая модуляция L-глутаматом и ГАМК симпатической передачи в изолированном семявыносящем протоке крысы. Br J Pharmacol 118: 755–761.
47. 47. Loscher W (1980) Сравнительное исследование фармакологии ингибиторов ГАМК-метаболизма. Наунин Шмидебергс Arch Pharmacol 315: 119–128.
48. 48. O’Byrne CP, Feehily C, Ham R, Karatzas KA (2011) Модифицированный быстрый ферментативный микротитровальный анализ на планшете для количественного определения внутриклеточной гамма-аминомасляной кислоты и сукцинатного полуальдегида в бактериальных клетках. J Microbiol Methods 84: 137–139.
49. 49. Чжан Дж. Х., Чунг Т. Д., Ольденбург К. Р. (1999) Простой статистический параметр для использования при оценке и валидации высокопроизводительных скрининговых анализов.J Biomol Screen 4: 67–73.
50. 50. Карнес Х.Т., Шиу Г., Шах В.П. (1991) Валидация биоаналитических методов. Pharm Res 8: 421–426.
51. 51. Naves T, Jawhari S, Jauberteau MO, Ratinaud MH, Verdier M (2013) Аутофагия имеет место в мутантных клетках нейробластомы p53 в ответ на гипоксический миметик CoCl (2). Biochem Pharmacol.
52. 52. Saxena S, Shukla D, Bansal A (2012) Увеличение аэробного дыхания и митохондриального биогенеза в скелетных мышцах путем предварительного кондиционирования гипоксии хлоридом кобальта.Toxicol Appl Pharmacol 264: 324–334.
53. 53. Gutierrez Correa J, Stoppani AO (1993) Инактивация липоамиддегидрогеназы системами Фентона кобальта (II) и железа (II): эффект хелаторов металлов, тиоловых соединений и нуклеотидов аденина. Free Radic Res Commun 19: 303–314.
54. 54. Madry C, Betz H, Geiger JR, Laube B (2008) Супралинейное усиление возбуждающих рецепторов глицина NR1 / NR3A антагонистом Zn2 + и NR1. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 12563–12568.
55. 55. Паолетти П., Верньяно А.М., Барбур Б., Касадо М. (2009) Цинк в глутаматергических синапсах. Неврология 158: 126–136.
56. 56. Smart TG, Hosie AM, Miller PS (2004) Ионы Zn2 +: модуляторы возбуждающей и ингибирующей синаптической активности. Невролог 10: 432–442.
57. 57. Треттер Л., Адам-Визи В. (2000) Ингибирование ферментов цикла Кребса перекисью водорода: ключевая роль α-кетоглутаратдегидрогеназы в ограничении производства НАДН при окислительном стрессе.J Neurosci 20: 8972–8979.
58. 58. Feehily C, Karatzas KA (2012) Роль метаболизма глутамата в ответах бактерий на кислотные и другие стрессы. J Appl Microbiol.
59. 59. Робертс С.С., Мендонка-Торрес М.С., Дженсен К., Фрэнсис Г.Л., Васко В. (2009) Экспрессия рецептора ГАМК в доброкачественных и злокачественных опухолях щитовидной железы. Патол Онкол Res 15: 645–650.
60. 60. Лю Ю., Ли Й., Го Ф. Дж., Ван Дж. Дж., Сан Р. Л. и др. (2008) Гамма-аминомасляная кислота способствует росту гепатоцеллюлярной карциномы человека за счет сверхэкспрессии альфа-3-субъединицы А-рецептора гамма-аминомасляной кислоты.World J Gastroenterol 14: 7175–7182.
61. 61. Takehara A, Hosokawa M, Eguchi H, Ohigashi H, Ishikawa O и др. (2007) Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) стимулирует рост рака поджелудочной железы за счет сверхэкспрессии субъединицы pi рецептора ГАМК. Cancer Res 67: 9704–9712.
62. 62. Young SZ, Bordey A (2009) GABA контролирует пролиферацию стволовых и раковых клеток в нервных и периферических нишах взрослых. Физиология (Bethesda) 24: 171–185.
63. 63. Capitani G, De Biase D, Aurizi C, Gut H, Bossa F и др.(2003) Кристаллическая структура и функциональный анализ глутаматдекарбоксилазы Escherichia coli. EMBO J 22: 4027–4037.
64. 64. Фостер JW (2004) Устойчивость к кислоте Escherichia coli: рассказы об ацидофиле-любителя. Nat Rev Microbiol 2: 898–907.
65. 65. Feehily C, O’Byrne CP, Karatzas KA (2012) Listeria monocytogenes имеет функциональный шунт гамма-амиобутирата (ГАМК): роль в кислотостойкости и биосинтезе сукцината Appl Environ Microbiol.
66. 66. Bouche N, Fromm H (2004) ГАМК в растениях: просто метаболит? Trends Plant Sci 9: 110–115.
67. 67. Shelp BJ, Bown AW, McLean MD (1999) Метаболизм и функции гамма-аминомасляной кислоты. Trends Plant Sci 4: 446–452.
68. 68. Estrella V, Chen T., Lloyd M, Wojtkowiak J, Cornnell HH и др. (2013) Кислотность, создаваемая микросредой опухоли, вызывает локальную инвазию. Cancer Res.
69. 69. Ибрагим-Хашим А., Корннелл Х. Х., Абрахамс Д., Ллойд М., Буй М. и др. (2012) Системные буферы ингибируют канцерогенез у мышей TRAMP. Дж. Урол 188: 624–631.
70. 70. Ибрагим Хашим А., Корннелл Х. Х., Коэльо Рибейро Мде Л., Абрахамс Д., Каннингем Дж. И др. (2011) Уменьшение метастазов с помощью энергонезависимого буфера. Clin Exp Metastasis 28: 841–849.
71. 71. Роби И.Ф., Баггетт Б.К., Киркпатрик Н.Д., Роу Д.Д., Досеску Дж. И др. (2009) Бикарбонат увеличивает pH опухоли и подавляет спонтанные метастазы. Cancer Res 69: 2260–2268.
72. 72. Адзума Х., Инамото Т., Сакамото Т., Кияма С., Убай Т. и др. (2003) Гамма-аминомасляная кислота как фактор, способствующий метастазированию рака; индукция продукции матриксной металлопротеиназы потенциально является лежащим в ее основе механизмом.Cancer Res 63: 8090–8096.
73. 73. Ким Ю.Г., Ли С., Квон О.С., Пак С.И., Ли С.Дж. и др. (2009) Модуляция редокс-переключателя человеческого SSADH с помощью динамической каталитической петли. Embo J 28: 959–968.
74. 74. Эдвардс Л.Дж., Уильямс Д.А., Гарднер Д.К. (1998) Внутриклеточный pH эмбриона мыши до имплантации: влияние внеклеточного pH и слабых кислот. Мол Репрод Дев 50: 434–442.
75. 75. Баклер KJ, Vaughan-Jones RD, Peers C, Lagadic-Gossmann D, Nye PC (1991) Влияние внеклеточного pH, PCO2 и HCO3- на внутриклеточный pH в изолированных клетках типа I каротидного тела новорожденных крыс.J Physiol 444: 703–721.
76. 76. Vander Heiden MG, Cantley LC, Thompson CB (2009) Понимание эффекта Варбурга: метаболические потребности пролиферации клеток. Наука 324: 1029–1033.
77. 77. Ковачевич З. (1971) Путь окисления глутамина и глутамата в изолированных митохондриях из клеток млекопитающих. Biochem J 125: 757–763.
78. 78. ДеБерардинис Р.Дж., Манкузо А., Дайхин Э., Ниссим И., Юдкофф М. и др. (2007) Помимо аэробного гликолиза: трансформированные клетки могут участвовать в метаболизме глутамина, который превышает потребность в синтезе белков и нуклеотидов.Proc Natl Acad Sci U S A 104: 19345–19350.
79. 79. Kobayashi S, Millhorn DE (2001) Гипоксия регулирует метаболизм глутамата и мембранный транспорт в клетках PC12 крысы. J Neurochem 76: 1935–1948.

границ | Уровни гамма-аминомасляной кислоты и глутаминовой кислоты в слуховом пути крыс с хроническим шумом в ушах: прямое определение с помощью протонной магнитно-резонансной спектроскопии с точечным разрешением с высоким разрешением (1H-MRS)

Введение

Хронический шум в ушах поражает большое количество людей, причем 3-5 процентов популяции, вызывающей шум в ушах, серьезно обеспокоены своим состоянием.Воздействие разрушительного звука высокого уровня, вероятно, является основной причиной шума в ушах у молодых людей (Muhr and Rosenhall, 2011) и второй по значимости причиной у пожилых людей (Nondahl et al., 2002). Повреждение периферической слуховой системы в долгосрочной перспективе снижает афферентный вход в центральную слуховую систему и, по-видимому, стимулирует компенсаторные центральные изменения. Компенсация или, возможно, чрезмерная компенсация может вызвать ощущение звука там, где его нет, например, шум в ушах. Нейронные корреляты шума в ушах, выявленные в исследованиях на животных, суммированы в таблице 1.Было выдвинуто предположение, что клеточные механизмы, ответственные за эти изменения, включают подавление ингибирующей нейротрансмиссии, например, опосредуемой нейромедиатором Γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) и / или повышающую регуляцию возбуждающей нейротрансмиссии, например, опосредованной возбуждающий нейротрансмиттер глутамат (Glu). Могут ли изменения концентрации этих соединений быть непосредственно обнаружены в мозгу животных с объективно подтвержденными признаками шума в ушах?

Таблица 1.Возможные компенсаторные механизмы, потенциально ответственные за компенсаторное «восстановление» центральной функции после повреждения сенсорного органа .

За последнее десятилетие животные модели внесли значительный вклад в нейробиологию тиннитуса (Roberts et al., 2010). Несмотря на разнообразие, все модели на животных предполагают, что ощущение шума в ушах является результатом относительно примитивных изменений в центральной слуховой обработке. У животных шум в ушах вызывается манипуляциями, такими как воздействие сильным звуком, которые обычно вызывают шум в ушах у людей.Наличие тиннитуса можно выявить с помощью надлежащим образом разработанных психофизических процедур (Brozoski and Bauer, 2008). В настоящем эксперименте были визуализированы мозги крыс с психофизическими признаками хронического шума в ушах, вызванного звуком, и были получены спектры протонного магнитного резонанса с точечным разрешением ( ¹ H-MRS) из объемов тканей, локализованных в областях слухового пути, которые были определены в одном или нескольких исследованиях как потенциально участвующие в опосредовании тиннитуса. Анализируемые области включали дорсальное ядро ​​улитки (DCN), нижний бугорок (IC), медиальное коленчатое тело (MGB) или слуховой таламус и первичную слуховую кору (A1).

Последние технические усовершенствования позволили получать спектры с хорошим разрешением для небольших объемов тканей. Спектроскопия с точечным разрешением (PRESS) может использоваться для оптимизации мощности сигнала от небольших объемов, в то время как ультракороткое время эхо-сигнала может использоваться для уменьшения мультиплетов сигнала, тем самым улучшая дисперсию пиков и разрешение сложных спектров, например, полученных из ткани мозга. Введение асимметричных РЧ-импульсов переменной мощности в последовательность зондов можно использовать для уменьшения в противном случае интрузивного пика воды, который скрывает сигналы выше 3 ppm (Mlynarik et al., 2008). Разделение спектральных линий и выделение слабых сигналов может быть дополнительно улучшено за счет использования магнитных полей очень высокого уровня и, кроме того, за счет использования настраиваемой звукоснимающей катушки (Одинцов, 2011).

В данном исследовании спектры были получены из представляющих интерес объемов мозга (VOI). Спектры мозга были откалиброваны по спектрам, полученным на стеклянных фантомах, заполненных известными концентрациями ГАМК и Glu и сопоставимых по размеру с VOI. ГАМК и Glu были выбраны для анализа, потому что они, соответственно, являются основными тормозными и возбуждающими нейротрансмиттерами в слуховом пути; их концентрации находятся на обнаруживаемых уровнях в небольших объемах мозга, и было установлено, что они потенциально играют значительную роль в тиннитусе.

Материалы и методы

Субъекты

Двадцать взрослых самцов крыс Long – Evans (Харлан, Индианаполис, Индиана), возрастом 90 дней в начале эксперимента, были индивидуально размещены и содержались при 25 ° C с 12/12 ч обратным режимом свет / темнота. За десять месяцев до спектроскопии 16 животных участвовали в исследовании, в котором изучали влияние дополнительного таурина с пищей на шум в ушах. Протокол эксперимента был одобрен Комитетом по уходу и использованию лабораторных животных Школы медицины Университета Южного Иллинойса и Университета Иллинойса в Урбана Шампейн.

Индукция тиннитуса

Половина животных ( n = 10) в одностороннем порядке подвергалась однократному воздействию полосно-ограниченного шума в течение 1 часа. Эти предметы будут называться «разоблаченными». С остальными животными ( n = 10) лечили идентично, но не подвергали воздействию. Они будут называться «неэкспонированными». Параметры звукового воздействия были идентичны тем, которые, как сообщалось ранее, вызывали шум в ушах у крыс (Bauer and Brozoski, 2001; Brozoski et al., 2012). Все субъекты, подвергшиеся и не подвергавшиеся воздействию, были подвергнуты анестезии до арефлексивного состояния с использованием смеси изофлуран / O2 (Aerrane, Baxter Healthcare Corp., Дирфилд, Иллинойс, США) или смесь кетамина / ксилазина (24,6 и 3 мг / кг соответственно; кетамин, кетасет, Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA; ксилазин, Anased, Lloyd Laboratories, Shenandoah, IA). Для подвергнутых воздействию животных пиковый уровень составлял 116 дБ (SPL) с центром на частоте 16 кГц, с полосой шума, падающей до уровня окружающей среды на частотах 8 кГц и 24 кГц. Звук передавался в монофоническом режиме с помощью динамика (FT17H, Fostex, Токио, Япония) в специальном корпусе, направляющем звук в гибкую трубку, которая плотно входила в слуховой проход.Уровни звука были откалиброваны с помощью системы измерения звука Pulse от Brüel and Kjaer (Норкросс, Джорджия, США) (программное обеспечение Pulse 13), оснащенной высокочастотным модулем 3560C и микрофоном поля давления 4138 (Brüel and Kjaer), подключенным к датчик с использованием резиновой трубки с внутренними размерами наружного слухового прохода взрослой крысы. Все уровни звука, указанные в настоящем эксперименте, являются невзвешенными уровнями давления 20 мкПа.

Уровни слуха

Пороги слуха были определены непосредственно до и после воздействия (для подвергшихся воздействию крыс) с использованием слуховых потенциалов ствола мозга (ABR).Они также были получены по завершении тестирования шума в ушах. Измерения ABR были получены либо с использованием системы обработки сигналов в реальном времени TDT System 3, работающей под управлением BioSig32 и SigGen (Tucker Davis Technologies, Алачуа, Флорида, США), либо с использованием системы IHS Smart EP, работающей под управлением программного обеспечения IHS High Frequency (v. 2.33) и с использованием Высокочастотные преобразователи IHS (HFT9911–20–0035, Intelligent Hearing Systems, Майами, Флорида). Вызванные ответы по-разному регистрировались от подкожного игольчатого электрода в вершине, относящегося к электроду на затылке.Вызванные ответы в течение 10-миллисекундных периодов после появления стимула были усилены × 100 000, полосовой фильтрацией (100–3000 Гц) и усреднены для 512 повторений каждой комбинации уровней частоты и интенсивности. Оцифрованные записи вызванных ответов (разрешение 40 мкс) экспортировали в Excel (Microsoft, Редмонд, Вашингтон, США) для анализа и определения пороговых значений. Пороги слуха для каждого уха определялись наименьшим уровнем стимула, который давал статистически отчетливые и визуально отличные вызванные волны, определяемые как максимальное отклонение от пика к пику в пределах окна 10 мс после начала стимула.Для анализа использовались специальные приложения, написанные для Excel.

Оценка тиннитуса

Тиннитус был измерен после звукового воздействия с помощью поведенческого анализа, который показал чувствительность к шуму в ушах у крыс и подробно описан в другом месте (Bauer and Brozoski, 2001; Brozoski et al., 2012). Вкратце, для определения восприятия животным тестовых тонов и периодов молчания, встроенных в среду с низким уровнем (60 дБ, SPL) широкополосного шума (BBN), использовали оперантную процедуру условного подавления.Ключевой особенностью процедуры было то, что животные должны были различать наличие и отсутствие звука при тестировании с помощью множества звуков, различающихся по составу, частоте и уровню. Хотя особенности тиннитуса у крыс (и людей) невозможно узнать напрямую, несомненно, что шум в ушах не может походить на тишину. Животных тестировали ежедневно в коммерческих испытательных камерах (Lafayette Instruments, Mod. 80001, Lafayette, IN, USA), оборудованных динамиками, закрепленными на крышке. Периоды выступлений (т.е., тишина) имело особое значение, потому что нажатие на рычаг для приема пищи во время периодов молчания приводило к сотрясению стопы в конце этого периода. Интересным поведением было нажатие на рычаг во время произвольно представленных тестовых звуков (длительность 1 мин), которые заменяли некоторые презентации с отключенным выступающим (также длительностью 1 мин). Сессии оценки состояли из 10 случайно вставленных, несмежных презентаций. Два из 10 всегда были периодами молчания (т. Е. Отключения динамиков). Остальные восемь презентаций имели случайно выбранный тон или шум с разными уровнями в каждой презентации.Нажатие рычага количественно оценивалось с использованием меры относительной скорости, степени подавления ( R ). R был определен как текущий показатель для последовательных 1-минутных сегментов каждого сеанса с использованием формулы R = B / ( A + B ), где A было количеством нажатий на рычаг в предшествующий 1-минутному сегменту и B количество нажатий на рычаг в текущем 1-минутном сегменте. R может варьироваться от 0 до 1. Значение 0 достигается, когда нажатие рычага в текущую минуту равно 0, то есть значение 0.5, когда нажатие на рычаг в текущую минуту равно нажатию на предыдущую минуту, и значение 1, когда нажатие на рычаг в предыдущую минуту равно нулю. R предоставил текущий индекс поведения в 1-минутных сегментах и ​​позволил проводить количественное сравнение между субъектами, а также беспристрастную компиляцию групповых данных. R — полезный индекс перцептивной деятельности, поскольку он очень чувствителен к краткосрочным поведенческим эффектам, например, вызванным сенсорными событиями, но очень нечувствителен к постепенным поведенческим эффектам, например, вызванным изменениями мотивационного статуса. , например, насыщение.В контексте настоящей процедуры ожидалось, что подвергшиеся воздействию крысы с тиннитусом будут иметь более низкие значения R , чем не подвергавшиеся воздействию крысы, при тестировании со стимулами, напоминающими их шум в ушах. Все сеансы тестирования длились 60 мин. Дальнейшие подробности психофизической процедуры можно найти в документе с открытым исходным кодом (Brozoski et al., 2012).

Облученных и необлученных крыс лечили одинаково и тестировали параллельно. Функции различения отдельных животных и групп были выведены из заключительных 3-5 сеансов каждой серии испытаний, где вариабельность показателей была минимальной.Тестовые стимулы представляли собой BBN и тоны 8, 10, 16, 20, 24 и 32 кГц. Каждый стимул был протестирован по диапазону уровней от низкого до высокого уровня слышимости. Признаки шума в ушах определялись расхождением функций групповой дискриминации. Для испытуемых с тиннитусом тестовые стимулы, похожие на их шум в ушах, служили сигналом для подавления реакции (нажатие на рычаг). Напротив, для неэкспонированных субъектов без шума в ушах сигналом к ​​подавлению была тишина. Таким образом, тестовые стимулы с сенсорными особенностями, напоминающими шум в ушах, производили большее подавление (т.е. меньшее количество нажатий на рычаг) у пациентов с шумом в ушах. Предыдущее исследование (Bauer and Brozoski, 2001) показало, что взрослые крысы Лонг-Эванса, в одностороннем порядке подвергающиеся высокоуровневому ограниченному по полосе шуму с центральной частотой 16 кГц, демонстрируют признаки шума в ушах в диапазоне от 10 до 30 кГц.

Спектроскопия: получение

Перед спектроскопией каждое животное в своей домашней клетке было помещено в звукоизолированную будку с двойными стенками на 20 часов без еды, но со свободной водой. Цель заключалась в том, чтобы уравнять базовую акустическую среду для всех субъектов и снизить акустическую среду до низкого уровня.Уровень шума в этой среде во всем диапазоне слышимых частот для крыс составлял менее 10 дБ (SPL). За десять минут до спектроскопии животных предварительно обрабатывали i.p. с 10 мг / кг 3-меркаптопропионовой кислоты (продукт M5801, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) для остановки посмертного инфляции ГАМК (van der Heyden and Korf, 1978). Непосредственно перед захватом животным вводили смертельную дозу анестетика (Euthasol, Virbac, Ft. Worth, TX), обезглавливали, удаляли нижнюю челюсть и отсекали лишнюю мышечную ткань от черепа.Головку помещали в полиэтиленовый держатель вместе со стеклянным капилляром диаметром 1 мм, заполненным CuSO4 (3 мМ). Фантом изображения капилляра проиндексировал левое полушарие, что сделало латеральность VOI однозначной.

Спектроскопия: калибровка

Перед получением спектра были приготовлены стеклянные сосуды диаметром 2 мм с 10 мМ ГАМК или 10 мМ Glu, растворенными в стерильном физиологическом растворе. Первоначальные попытки включить один или несколько калибровочных сосудов вместе с мозгом во время сбора спектрографических данных искажали поле, делая невозможным шиммирование.Таким образом, калибровочные спектры были получены либо до, либо после получения спектров мозга. Первоначальные калибровки были выполнены с ГАМК и Glu в сочетании с такими соединениями, как креатин, которые, как ожидалось, будут давать нежелательные спектральные линии, потенциально скрывающие линии ГАМК и Glu. Спектрограммы смесей использовались для идентификации пиков ГАМК и Glu среди их мультиплетов, что обеспечивало наиболее четкое отделение от фона. Калибровка и выбор пиков были дополнительно уточнены с использованием массивов фантомов, распределенных в поле зрения, как показано на рисунке 1.Принимая во внимание все результаты калибровки, уровни ГАМК определялись с использованием пика при 2,18 ppm и Glu с использованием пика при 3,68 ppm (рис. 2).

Рис. 1. Калибровка спектров ГАМК с использованием набора фантомов, каждый из которых содержит 10 мМ ГАМК в стерильном физиологическом растворе, распределенных по полю обзора изображения. Использование нескольких фантомов, расположенных по всему полю зрения, иллюстрирует оптимизированное шиммирование поля и выбор наименее вариативного спектрального пика из числа мультиплетов в каждом месте, используемых для количественной оценки интересующего соединения (в данном примере — ГАМК).

Рис. 2. Калибровочные спектры ГАМК и Glu, полученные с использованием тех же параметров сканирования (подробности см. В разделе «Методы»), которые использовались для захвата спектров VOI. Пик из числа мультиплетов, используемых для количественного определения ГАМК и Glu, показан указателем.

Спектроскопия: сбор данных

По завершении поведенческого тестирования крыс индивидуально визуализировали и определяли объемно-локализованные спектры ¹ H-MRS. Спектры получали с использованием спектрометра ЯМР Varian Unity / Inova 600 мГц с вертикальным отверстием и 14.Магнит 1 Тл. Для уменьшения ошибки смещения локализованного микрообъема ¹ H-MRS, вызванной большими химическими сдвигами в сильном магнитном поле, была использована гибридная последовательность коротких импульсов, полученная от R. Gruetter (Mlynarik et al., 2008). Последовательность импульсов была оптимизирована для получения сигнала в спектральном диапазоне, содержащем интересующие нейрохимические вещества, то есть ГАМК и Glu. Дальнейшая оптимизация сигналов проводилась с помощью перестраиваемой звукоснимающей катушки (Одинцов, 2011).

Для каждого животного использовалось исходное МРТ-сканирование мозга для определения VOI для ¹ H-MRS.Были получены смежные поперечные (т. Е. Коронковые) срезы толщиной 0,5 мм (планарное разрешение 26 мкм), простирающиеся на 13 мм каудально от Bregma (всего 26 срезов). VOI для ¹ H-MRS определяли в пределах слухового пути, как показано в таблице 2. VOI для каждой слуховой области сохраняли постоянным, и его размещение было сделано как можно более стандартным с использованием контрольных точек изображения. ¹ Спектры H-MRS были получены с обеих сторон в порядке, указанном в таблице 2, с параметрами сбора данных, оптимизированными для каждого VOI.При шиммировании пик воды для всех спектров поддерживался постоянным на уровне 4,7 ppm, а ширина его линии была минимальной (обычно 30–45 Гц). Трехсот повторений сканирования было достаточно для разрешения всех спектров, за исключением DCN (Таблица 2).

Таблица 2. ¹ Параметры сбора данных H-MRS .

Спектроскопия: анализ данных

Спектры в виде изображений TIFF были импортированы в изображение J (версия 1.44p, http://imagej.nih.gov/ij). Пики, наиболее близкие к калибровочным пикам для ГАМК и Glu, были очерчены, и была определена площадь под каждой кривой (AUC) для каждого.AUC были выражены в единицах базовой линии спектра (т.е. нижней границы кривой) для корректировки усиления изображения. Значения AUC были скопированы в электронную таблицу Excel (2007, Microsoft, Redmond, WA) для анализа. AUC каждого нейрохимического вещества была преобразована в уровень концентрации (мМ) с учетом объема VOI, объема калибровочного сосуда, известной калибровочной концентрации и калибровочной AUC, как указано в уравнении 1.

Было проведено попарное сравнение экспонированных и необлученных VOI.Сообщенные уровни значимости были получены из независимых тестов t .

Результаты

Признаки тиннитуса

Значительный шум в ушах был очевиден у подвергшихся воздействию крыс примерно через четыре месяца после воздействия. Протокол в настоящем эксперименте (воздействие до психофизической тренировки и тестирования) показывает, что шум в ушах является понижением функций распознавания. Это происходит потому, что сенсорный коррелят периодов отключения говорящих, то есть шум в ушах у животных, подвергшихся воздействию, является условным стимулом для подавления реакции.Следовательно, стимулы, напоминающие ощущение отключения говорящего, подавляют реакцию. Подавление, зависящее от частоты, было очевидным как для индивидуальных (рис. 3), так и для групповых данных (рис. 4) в диапазоне от 16 до 24 кГц. Отдельные испытуемые показали некоторые вариации в частотном диапазоне подавления, от довольно узкого (Рисунок 3A) до широкого (Рисунок 3B). Это может отражать тональность их шума в ушах. Кроме того, у некоторых людей наблюдались признаки шума в ушах и гиперакузии. Тем не менее, все крысы, подвергшиеся воздействию, показали некоторые признаки шума в ушах.

Рисунок 3. Примеры шума в ушах у отдельных крыс. (A) Крыса с очаговым узкополосным шумом в ушах около 20 кГц и (B) Крыса с довольно широкополосным шумом в ушах, локализованным между 10 и 24 кГц. Планки погрешностей показывают стандартную ошибку среднего значения для неэкспонированной группы. Относительная скорость нажатия рычага, обозначенная коэффициентом подавления (см. Текст), показана на оси x , а тестовый стимул по уровням стимула (дБ, SPL) показан на оси x .

Рис. 4. Групповые признаки тиннитуса, зависящие от частоты. Статистика на каждой панели представляет собой сравнение подвергнутых и неэкспонированных групп для уровней стимула, превышающих настройку ВЫКЛ. Как и на рисунке 3, относительное нажатие рычага показано на оси x , а тестовый стимул по уровням показан на оси x . Планки погрешностей показывают стандартную ошибку среднего.

Уровни ГАМК и Glu

¹ Данные H-MRS были собраны по завершении психофизического тестирования.В спектральный анализ были включены данные от шести облученных и пяти необлученных крыс. Данные семи исходных крыс использовались для корректировки и оптимизации экспериментальных параметров и не были включены в окончательный анализ. Данные двух крыс были отброшены при обнаружении опухолей гипофиза. Средний возраст на момент проведения спектроскопии составлял 19,8 и 17,8 месяцев, соответственно, для экспонированных и необлученных животных. Средний интервал между экспозицией и спектроскопией составил 16,2 месяца. Для получения спектров от одного животного вместе с сопутствующей регулировкой поля потребовалось около 7 часов.Один сеанс проводился в день. Спектры четырех представляющих интерес областей слуха: DCN, IC, MGB и A1 представлены на рисунках 5–8. На каждом рисунке показан выбор VOI на верхней панели, репрезентативный индивидуальный спектр из этого VOI на центральной панели и расчетные средние уровни GABA и Glu для экспонированных и контрольных животных на нижней панели. Расчетные уровни GABA и Glu в мМ сообщаются отдельно для каждого полушария, ипсилатерального и контралатерального, в зависимости от воздействия звука. Снижение концентрации ГАМК было очевидным только в MGB, с наибольшим снижением по сравнению с неэкспонированными контролями, полученными в контралатеральном MGB (Рисунок 7; p = 0.033). Уровни ГАМК в подвергнутом воздействию МГБ составляли 0,38 мМ (± 0,18) на противоположной стороне и 1,62 мм (± 0,64) на ипсилатеральной стороне, по сравнению с необработанными уровнями 2,77 мм (± 1,04) на противоположной стороне и 2,57 мм (± 1,39) на ипсилатеральной стороне. Ошибка (±) — стандартная ошибка среднего. Следовательно, снижение ГАМК и потенциальная потеря опосредованного ГАМК ингибирования были наиболее очевидны в слуховом таламусе в прямом пути от открытого уха, то есть контралатеральном MGB. Небольшое увеличение ГАМК могло присутствовать с обеих сторон в A1 (Рисунок 8) и в контралатеральном DCN (Рисунок 5), однако эти различия не были статистически значимыми.

Рис. 5. Уровни ГАМК и Glu (мМ / мл) в дорсальном ядре улитки (DCN) подвергшихся и не подвергавшихся воздействию крыс. Верхняя панель: размер и расположение ВОИ; Средняя панель: типичный индивидуал ¹ H-MRS; Нижняя панель: средние групповые уровни ГАМК и Glu. Планки погрешностей показывают стандартную ошибку среднего. Звездочка рядом с меткой оси указывает прямой путь к уху, подвергшемуся травме. Звездочка рядом со строкой данных указывает на статистическую значимость ( p ≤ 0.05).

Рис. 6. Уровни ГАМК и Glu (мМ / мл) в нижнем холмике (IC) подвергшихся и не подвергавшихся воздействию крыс. Не было получено значительных различий между подвергнутыми и не подвергавшимися воздействию животными в IC. Графические параметры как на рисунке 5.

Рис. 7. Уровни ГАМК и Glu (мМ / мл) в медиальном коленчатом теле (MGB) крыс, подвергшихся и не подвергавшихся воздействию. Концентрации ГАМК и Glu были значительно ниже в контралатеральном MGB у животных, подвергшихся воздействию.Графические параметры как на рисунке 5.

Рис. 8. Уровни ГАМК и Glu (мМ / мл) в первичной слуховой коре (A1) крыс, подвергшихся и не подвергавшихся воздействию. Хотя различия между подвергнутыми и необлученными животными не были статистически значимыми, уровни значимости могли быть замаскированы вариабельностью измерений, происходящей из-за анизотропии поля, а не из-за нейрохимической вариабельности. Графические параметры как на рисунке 5.

Вариация уровня Glu, как внутри, так и между группами лечения, была выше, чем вариация ГАМК.Несмотря на вариации, уровень Glu был значительно ( p = 0,039) повышен в экспонированной ипсилатеральной DCN, 18,77 мМ (± 9,76), в то время как в неэкспонированной среде — 12,36 мМ (± 2,32). Контралатеральные уровни DCN Glu достоверно не различались у крыс, подвергшихся и не подвергавшихся воздействию. Контралатеральный экспонированный уровень составлял 6,52 мМ (± 5,00), в то время как неэкспонированный — 3,08 мМ (± 2,09) (рис. 5). Уровни Glu на ипсилатеральном и контралатеральном воздействии были повышены в A1 по сравнению с контрольной группой, не подвергавшейся воздействию, но незначительно (Рисунок 8; p = 0.082, ипсилатеральный; p = 0,145, контралатеральный). Однако на значимость отрицательно повлияла большая вариация в спектрах, полученных с помощью A1. Шиммирование поля было затруднено для A1, и это предполагало, что изменение измерения могло быть следствием анизотропии поля вблизи периферии, а не собственными тканевыми факторами. A1, подвергнутый воздействию ипсилатерального Glu, был 3,12 мМ (± 1,64), а неэкспонированный — 1,32 мМ (± 0,54). Облученный контралатеральный A1 Glu составлял 2,60 мМ (± 1,55), а неэкспонированный — 0,81 мМ (± 0.59).

В MGB Glu был значительно снижен контралатерально (1,24, ± 0,67 против 4,55, ± 1,13; p = 0,029) и незначительно увеличивался ипсилатерально (4,36, ± 1,91 против 2,59, ± 1,11; p = 0,448 ). Таким образом, эти результаты предполагают усиление Glu-опосредованного возбуждения в DCN и, возможно, в A1, хотя вариации в корковых уровнях скрывают значимость. В ИК различия между экспонированными и неэкспонированными группами как в ГАМК, так и в Glu были небольшими (рис. 6).

Пороги слуха

Звуковое воздействие, вызывающее шум в ушах, было односторонним.Это было сделано для того, чтобы сохранить пороги слышимости в свободном поле, что является требованием для психофизического тестирования. Сразу после воздействия (пиковый уровень звука 116 дБ, SPL) пороги слышимости на открытом ухе, как показано ABR, были повышены примерно на 60 дБ при 20 кГц (рис. 9, верхняя панель). Пороги для неэкспонированных ушей не были затронуты экспозицией. По завершении психофизического тестирования и до сбора данных MRS пороговые значения ABR для открытых ушей вернулись к нормальным уровням (рисунок 9, нижняя панель).Восстановление пороговой чувствительности типично для этого уровня воздействия (Bauer, Brozoski, 2001) у крыс Long Evans.

Рис. 9. Пороговые значения слуховой реакции ствола мозга у крыс, подвергшихся и не подвергавшихся воздействию. Верхняя панель: пороги до и сразу после акустического воздействия. Значительное повышение порога было очевидно только в открытом ухе. Нижняя панель: пороговые значения перед спектроскопией показывают нормальные уровни в обеих группах. Планки погрешностей показывают стандартную ошибку среднего.

Обсуждение

Уровень громкости в сравнении с уровнем нейротрансмиттера

Настоящие результаты показали, что наблюдалось снижение ГАМК в MGB и увеличение Glu как в DCN, так и в A1, что сопровождалось хроническим шумом в ушах на модели крыс. Это подтверждает гипотезу о том, что регионально-специфическая потеря ингибирования и повышенная возбуждающая нейротрансмиссия лежат в основе хронического акустически индуцированного шума в ушах. Однако поддержка гипотезы о нейромедиаторах должна быть умеренной, если принять во внимание ограничения текущего метода.Нейрохимические концентрации были определены ex vivo , используя ¹ H-MRS с точечным разрешением и магнит 14,1 Тл. Спектры были эффективно разрешены от объемов до 4,5 мм ³ (т.е. объем DCN). Но указанные уровни отражают концентрации представляющих интерес соединений во всем объеме ткани, из которого были получены спектры. Используя МРТ каждого мозга, мы позаботились о том, чтобы измерительный объем был полностью помещен в каждую интересующую область. Однако внутри каждого VOI ¹ H-MRS не может различать концентрации в определенных суб-VOI компартментах, например, в везикулах нейромедиатора.Помимо своей роли в качестве нейротрансмиттеров, ГАМК и Glu также участвуют в общих метаболических функциях, например, как компоненты цикла ГАМК цикла трикарбоновых кислот. Еще одна сложность заключается в том, что ГАМК получают из Glu путем ферментативного декарбоксилирования. Следовательно, уровни концентрации, указанные в настоящем исследовании, не могут быть истолкованы как уровни нейротрансмиттеров. Однако в настоящем эксперименте сравнивали подвергшихся и необлученных крыс, леченных одинаково, за исключением одного сильного звукового воздействия.В среднем звуковое воздействие происходило за 16 месяцев до спектроскопии. Маловероятно, что общие метаболические последствия воздействия повлияют на результаты. Разумной интерпретацией было бы то, что различия в уровнях ГАМК и Glu между группами лечения отражают функциональные изменения, сильно зависящие от вариаций нейромедиаторов (Stagg et al., 2011b).

Сообщаемые уровни, калибровка и сравнение с другими оценками

Уровни ГАМК и Glu, указанные в настоящем исследовании, были концентрации, определенные в соответствии с внешними калибровочными стандартами (см. Методы).Напротив, во многих исследованиях ^-1 H-MRS сообщается об относительных уровнях по отношению к внутреннему стандарту, который является другим сигналом в спектре, таким как сигнал N-ацетиласпартата (Stagg et al., 2011a) или воды (Puts и др., 2011). При использовании внутреннего стандарта следует исходить из того, что концентрация стандартного соединения остается постоянной в зависимости от условий и VOI. Преимущество использования внутреннего стандарта состоит в том, что изменение местных условий измерения, например параметров регулировки шиммирования, не влияет на сообщаемые значения.Основным недостатком использования внутреннего стандарта является то, что концентрация стандартного соединения может быть непостоянной для разных людей и условий, что влияет на указанные соотношения. Второй недостаток заключается в том, что можно указать только относительные отношения уровней, фактические уровни концентрации остаются неизвестными. При использовании внешнего стандарта, как в настоящем исследовании, уровни физической концентрации известны, и изменение внутреннего стандарта не имеет значения. Однако при использовании внешнего стандарта точность зависит от метода калибровки.Внешний метод, описанный в настоящем исследовании, попытался установить как реалистичные, так и стабильные условия калибровки (рисунки 1 и 2). Калибровочные спектры были получены для фантомов, близких по объему к VOI и заполненных реалистичными концентрациями ГАМК и Glu. Калибровочные спектры также определялись по времени рядом со спектрами мозга. К сожалению, попытки одновременной калибровки путем включения фантомов вместе с мозгом во время сбора данных не увенчались успехом.Калибровочные фантомы, включенные вместе с мозгом, создавали искажения поля, которые делали шиммирование невозможным. Кроме того, размещение фантомов рядом с мозгом помещало фантомы на периферию поля, где локально плохая изотропия давала калибровочные спектры низкого качества.

Уровни Glu, о которых сообщалось в настоящем исследовании, варьировались от 0,81 до 18,77 мМ, в то время как уровни ГАМК варьировались от 0,09 до 2,77 мМ, в зависимости от VOI. Эти уровни ex vivo сопоставимы с уровнями, о которых сообщают другие, использующие аналогичные методы ¹ H-MRS.Млынарик и др. (Mlynarik et al., 2008) сообщили об уровнях Glu в головном мозге крысы 10,3 (± 8%) и уровне ГАМК 1,5 (± 13%) мМ / кг. По сравнению с современными исследованиями с использованием традиционных количественных аналитических методов, уровни Glu, представленные в настоящем исследовании, находились в пределах допустимого диапазона, в то время как уровни ГАМК были несколько выше. Например, в недавнем отчете (Zhu et al., 2011) с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии текущего поколения и гомогенатов всего мозга сообщалось, что уровни ГАМК в мозге взрослых крыс составляют около 0.5 (± 25%) мМ / мг и уровни Glu 10 (± 10%) мМ / мг. Несоответствие ГАМК между настоящим исследованием и исследованием (Zhu et al., 2011) может быть связано с различиями между методами, жидкостной хроматографией в зависимости от экстракции растворителем из гомогенатов всего мозга и ¹ H-MRS в зависимости от спектров, полученных из in situ ткань слухового пути. Также может быть, что в настоящем исследовании наблюдалось некоторая инфляция ГАМК, несмотря на использование 3-меркаптопропионовой кислоты для остановки посмертного повышения.Ошибка раздувания ГАМК, если она присутствует, должна была повлиять на подвергшихся и не подвергавшихся воздействию крыс в равной степени, поскольку уровни ГАМК (и Glu) определялись с использованием одинаковой процедурной последовательности для всех животных (Таблица 2).

ГАМК Уменьшение МГБ

Было высказано предположение, что потеря ингибирования центрального слухового пути лежит в основе хронического шума в ушах (Holt et al., 2010; Wang et al., 2011; Brozoski et al., 2012). Косвенные доказательства, подтверждающие эту гипотезу, получены из фармакологических исследований, в которых было показано, что системное введение агонистов ГАМК снижает или устраняет поведенческие признаки тиннитуса (Brozoski et al., 2007б, 2010; Ян и др., 2011). Гипотеза также косвенно подтверждается исследованиями, показывающими повышенный уровень спонтанной нервной активности у животных с признаками тиннитуса (Brozoski et al., 2002; Kaltenbach and Godfrey, 2008; Middleton et al., 2011). Роль MGB, т. Е. Слухового таламуса, в тиннитусе в настоящее время не определена. Недавние визуальные данные свидетельствуют о том, что измененные таламические цепи могут передавать аномальную спонтанную активность ствола мозга к коре и лимбическим структурам у пациентов с тиннитусом (Rauschecker et al., 2010). MGB является обязательным ретранслятором для восходящей слуховой информации. Потеря торможения в MGB может усилить влияние спонтанной активности ствола мозга на высшие процессы и вызвать восприятие звука в отсутствие периферической стимуляции. Понимание функции ГАМК в МГБ в настоящее время развивается. Плотность постсинаптических рецепторов ГАМК-А довольно низкая (Halonen et al., 2009). Однако рецепторы GABA-A, содержащие субъединицу δ вместо более распространенной субъединицы γ, имеют высокую плотность в MGB по сравнению с другими областями переднего мозга (Halonen et al., 2009; Ричардсон и др., 2011). Содержащие δ-субъединицу рецепторы ГАМК-А, по-видимому, в первую очередь внесинаптические и ответственны за опосредование тонического торможения (Richardson et al., 2011). Это предполагает, что окружающая внеклеточная ГАМК важна для регулирования общего баланса торможения / возбуждения в MGB. Тиннитус может быть опосредован потерей передачи тормозного объема в MGB, опосредованной подавлением внеклеточной ГАМК. Хотя плотность ГАМКергических интернейронов в MGB крысы, по-видимому, очень низкая (Winer and Larue, 1996), было показано, что глия является значительным источником ГАМК в других областях мозга (Olah et al., 2009). Потеря MGB GABA, о которой сообщалось в настоящем эксперименте, может отражать снижение внеклеточных уровней, а также снижение уровней в глии. Чистое уменьшение торможения увеличивало ростральное возбуждение.

Llinas et al. (2005) представляют модель кортико-таламической сети для учета шума в ушах и других нейропсихиатрических расстройств. Согласно их модели, обратная связь кортикальных пирамидных клеток со слуховым таламусом, как косвенно, через ретикулярное ядро ​​таламуса, так и напрямую, обеспечивает низкочастотные тальмокортикальные колебания.В этой модели предполагается, что потеря афферентного тормозящего воздействия на таламус приводит к усилению «краевого эффекта» низкочастотных (8 Гц) колебаний, в результате чего возникает ощущение шума в ушах. Интересно, что модель также предсказывает усиление низкочастотных колебаний и, предположительно, связанного с ними шума в ушах при наличии «длительной гиперполяризации таламических клеток» (Llinas et al., 2005). Следовательно, в модели Llinas ожидается, что повышенный уровень ГАМК, присущий MGB, вызовет хронический шум в ушах.Настоящие результаты, однако, показывают прямо противоположное: у крыс с тиннитусом уменьшилось количество ГАМК МГБ. Для ответа на более подробные вопросы, касающиеся роли ГАМК в определенных цепях, потребуются дальнейшие исследования с разрешением на клеточном уровне.

Glu Увеличение DCN

В дополнение к пониженным уровням MGB GABA, настоящее исследование также показало умеренно повышенные уровни Glu в DCN. Повышенная спонтанная нервная активность в DCN связана с шумом в ушах на моделях грызунов (Brozoski et al., 2002; Kaltenbach et al., 2004), в то время как измененная тонотопическая организация слуховой коры также была связана с тиннитусом у крыс (Yang et al., 2011). Фактически, может наблюдаться повсеместное усиление центральных функций усиления после потери чувствительности, например, вызванной травматическим воздействием звука высокого уровня (Norena, 2011). Адаптивные изменения функции мозга в первую очередь опосредуются пластичными глутаматергическими синапсами через долгосрочную потенциацию (LTP) и долгосрочную депрессию (LTD) (Zhuo, 2009; Lovinger, 2010; Kullmann and Lamsa, 2011).В то время как LTP и LTD, как описано in vitro , имеют продолжительность всего около часа, ясно, что те же процессы вовлечены в хронические изменения, которые были зарегистрированы у взрослых крыс A1 в контексте специфических фармакологических и акустических воздействий. (Hogsden et al., 2011). Повышенные уровни Glu в DCN и A1, обнаруженные в настоящем исследовании у крыс с хроническим шумом в ушах, вполне могут отражать очень долгосрочное увеличение возбуждающей нейротрансмиссии. И LTP, и LTD были идентифицированы в локальных сетях DCN (Tzounopoulos et al., 2007). Более того, связанные с Glu изменения функции ядра улитки были идентифицированы после повреждения улитки (Zeng et al., 2009).

Нулевой эффект в нижнем бугорке (IC)

Учитывая значительные доказательства того, что ИК участвует в хроническом тиннитусе у животных (Brozoski et al., 2007a; Holt et al., 2010) и людей (Gu et al., 2010), было несколько удивительно, что ни уровни ГАМК, ни Glu в ИК различались у животных, подвергшихся воздействию, и у животных, не подвергавшихся воздействию (рис. 6).Одно из объяснений может заключаться в том, что средний уровень нервной активности был лишь незначительно повышен в IC у животных, подвергшихся воздействию. Несмотря на то, что нейронный коррелят в тиннитусе в значительной степени связан с тиннитусом, нейронный коррелят в ИК может включать в себя изменения в паттернах нейронной активности, такие как нечастые всплески высокочастотных всплесков и уменьшение дисперсии интервала между спайками (Bauer et al., 2008), а не общий уровень. увеличивается. Таким образом, объемные изменения GABA и Glu могут быть не очевидны. Также можно отметить, что исследования, сообщающие о потере рецепторов IC GABA после повреждения улитки, также сообщают о постоянном повышении порога (Dong et al., 2010). В настоящем исследовании пороги слышимости были в основном нормальными во время тестирования шума в ушах и спектроскопии (рис. 9, нижняя панель).

Значение терапии тиннитуса

В настоящее время в клинической практике не существует обычно эффективных терапевтических вмешательств при тиннитусе. Напротив, на животных моделях тиннитуса было обнаружено, что несколько агонистов ГАМК эффективно ослабляют или устраняют признаки шума в ушах (Brozoski et al., 2007b, 2010; Yang et al., 2011).Интересно, что хотя периферическая блокада глутаматергических NMDA-рецепторов улитки ослабляет шум в ушах, вызванный акустической травмой, на модели крыс (Guitton and Dudai, 2007), введение системного антагониста NMDA кетамина оказалось неэффективным (Yang et al., 2011). Клинически ни агонисты ГАМК, например многие доступные производные бензодиазепина, ни антагонисты NMDA не показали эффективности в хорошо контролируемых испытаниях. Настоящее исследование предполагает, что комбинированный подход, направленный как на снижение функции ГАМК, так и повышение функции Glu, может быть более плодотворным.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

При поддержке Национального института глухоты и других коммуникативных расстройств, № 1R01DC009669–01.

Список литературы

Бауэр, К. А., Брозоски, Т. Дж. (2001). Оценка тиннитуса и перспективных терапевтических средств в ушах с использованием психофизической модели на животных. J. Assoc. Res. Отоларингол . 2, 54–64.

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст

Бауэр, К. А., Тернер, Дж. Г., Каспари, Д. М., Майерс, К. С., Брозоски, Т. Дж. (2008). Тиннитус и активность нижних бугорков у шиншилл связаны с тремя различными типами травм улитки. J. Neurosci. Res . 86, 2564–2578.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Брозоски, Т. Дж., И Бауэр, К. А. (2008). Узнавание о тиннитусе на животной модели. Семин. Послушайте . 29, 242–258.

Брозоски, Т. Дж., Бауэр, К. А., и Каспари, Д. М. (2002). Повышенная активность веретенообразных клеток в дорсальном ядре улитки шиншилл с психофизическими признаками шума в ушах. Дж. Neurosci . 22, 2383–2390.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст

Брозоски, Т. Дж., Каспари, Д. М., Бауэр, К. А., и Ричардсон, Б. Д. (2010). Влияние дополнительного диетического таурина на шум в ушах и слуховую дискриминацию на животной модели. Слушай. Res . 270, 71–80.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Брозоски, Т. Дж., Чобану, Л., и Бауэр, К. А. (2007a). Центральная нервная активность у крыс с тиннитусом оценивалась с помощью магнитно-резонансной томографии с усилением марганца (MEMRI). Слушай. Res . 228, 168–179.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Брозоски, Т. Дж., Спайерс, Т. Дж., И Бауэр, К. А. (2007b). Вигабатрин, ингибитор трансаминазы ГАМК, обратимо устраняет шум в ушах на животной модели. J. Assoc. Res. Отоларингол . 8, 105–118.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Брозоски, Т. Дж., Виснер, К. В., Сиберт, Л. Т., и Бауэр, К. А. (2012). Двусторонние поражения дорсального ядра улитки предотвращают шум в ушах, вызванный акустической травмой, в модели на животных. J. Assoc. Res. Отоларингол . 13, 55–66.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Донг С., Роджер Дж., Малдерс В. Х. и Робертсон Д.(2010). Тонотопические изменения экспрессии рецепторов ГАМК в нижних бугорках морских свинок после частичной односторонней потери слуха. Brain Res . 1342, 24–32.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Гу, Дж. У., Халпин, К. Ф., Нам, Э. К., Левин, Р. А., и Мелчер, Дж. Р. (2010). Тиннитус, снижение толерантности к уровню звука и повышенная слуховая активность у людей с клинически нормальной слуховой чувствительностью. J. Neurophysiol . 104, 3361–3370.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Халонен, Л. М., Синкконен, С. Т., Чандра, Д., Гоманикс, Г. Э., Корпи, Э. Р. (2009). Региональное распределение рецепторов ГАМК (А), проявляющих атипичный агонизм ГАМК: роль субъединиц рецептора. Neurochem. Инт . 55, 389–396.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Хогсден, Дж. Л., Розен, Л. Г., и Дрингенберг, Х. С. (2011). Фармакологическое и вызванное депривацией восстановление ювенильной долговременной потенциации в первичной слуховой коре взрослых крыс. Неврология 186, 208–219.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Холт А.Г., Биссиг Д., Мирза Н., Раджа Г. и Берковиц Б. (2010). Доказательства ключевых областей мозга, связанных с тиннитусом, задокументированные уникальной комбинацией МРТ с усилением марганца и акустического тестирования рефлекса испуга. PLoS One 5, e14260. DOI: 10.1371 / journal.pone.0014260

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Кальтенбах, Дж.А., Захарек, М. А., Чжан, Дж., И Фредерик, С. (2004). Активность в дорсальном ядре улитки хомяков, ранее проверенных на шум в ушах после интенсивного звукового воздействия. Neurosci. Lett . 355, 121–125.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Ллинас, Р., Урбано, Ф. Дж., Лезник, Э., Рамирес, Р. Р., и ван Марл, Х. Дж. (2005). Ритмическая и аритмичная таламокортикальная динамика: системы ГАМК и краевой эффект. Trends Neurosci .28, 325–333.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Миддлтон, Дж. У., Киритани, Т., Педерсен, К., Тернер, Дж. Г., Шеперд, Г. М., и Цунопулос, Т. (2011). Мыши с поведенческими признаками шума в ушах демонстрируют гиперактивность дорсального кохлеарного ядра из-за снижения ГАМКергического ингибирования. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 108, 7601–7606.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Млынарик, В., Кудалбу, К., Xin, L., и Gruetter, R. (2008). 1H ЯМР-спектроскопия головного мозга крысы in vivo при 14,1 Тесла: улучшение количественной оценки нейрохимического профиля. J. Magn. Резон . 194, 163–168.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Нондаль, Д. М., Крукшенкс, К. Дж., Уайли, Т. Л., Кляйн, Р., Кляйн, Б. Э. и Твид, Т. С. (2002). Распространенность и 5-летняя частота шума в ушах среди пожилых людей: исследование эпидемиологии потери слуха. J. Am. Акад. Audiol . 13, 323–331.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст

Одинцов Б. (2011). Перестраиваемая радиочастотная катушка . Заявка на патент США 61081954. 1 ноября 2011 г.

Олах, С., Фуле, М., Комлоси, Г., Варга, К., Балди, Р., Барзо, П., и Тамас, Г. (2009). Регуляция корковых микросхем за счет унитарной передачи объема, опосредованной ГАМК. Природа 461, 1278–1281.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Путс, Н.А., Эдден, Р. А., Эванс, К. Дж., Макглон, Ф., и Макгонигл, Д. Дж. (2011). Концентрация ГАМК человека в зависимости от региона коррелирует с порогами тактильной дискриминации. Дж. Neurosci . 31, 16556–16560.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Ричардсон Б. Д., Линг Л. Л., Утешев В. В. и Каспари Д. М. (2011). Внесинаптические рецепторы ГАМК (А) и тоническое ингибирование в слуховом таламусе крыс. PLoS One 6, e16508. DOI: 10,1371 / журнал.pone.0016508

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Робертс, Л. Е., Эггермонт, Дж. Дж., Каспари, Д. М., Шор, С. Е., Мельчер, Дж. Р., и Кальтенбах, Дж. А. (2010). Звон в ушах: неврология тиннитуса. Дж. Neurosci . 30, 14972–14979.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Цунопулос Т., Рубио М. Э., Кин Дж. Э. и Трассел Л. О. (2007). Коактивация пре- и постсинаптических сигнальных механизмов определяет клеточно-специфическую пластичность, зависящую от времени спайков. Нейрон 54, 291–301.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

van der Heyden, J. A., and Korf, J. (1978). Региональные уровни ГАМК в головном мозге: быстрый полуавтоматический анализ и предотвращение посмертного повышения с помощью 3-меркаптопропионовой кислоты. Дж. Нейрохим . 31, 197–203.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст

Winer, J. A., and Larue, D. T. (1996). Эволюция ГАМКергических цепей в медиальном коленчатом теле млекопитающих. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 93, 3083–3087.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст

Ян С., Вайнер Б. Д., Чжан Л. С., Чо С. Дж. И Бао С. (2011). Гомеостатическая пластичность влияет на восприятие шума в ушах у животных. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 108, 14974–14979.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Цзэн К., Наннапанени Н., Чжоу Дж., Хьюз Л. Ф. и Шор С. (2009). Повреждение улитки изменяет распределение везикулярных транспортеров глутамата, связанных со слуховыми и неаудиторными входами в ядро ​​улитки. Дж. Neurosci . 29, 4210–4217.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Чжу, К. Ю., Фу, К., Люн, К. В., Вонг, З. К., Чой, Р. К., и Цим, К. В. (2011). Создание чувствительного метода одновременного определения различных нейротрансмиттеров в головном мозге крыс с использованием тандемной масс-спектрометрии жидкостной хроматографии и электрораспыления. J. Chromatogr. Б Аналит. Technol. Биомед. Life Sci . 879, 737–742.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст