Пробионт это: пробионт — это… Что такое пробионт?

Одной из основных задач морской аквакультуры является непрерывное и надежное производство молоди. Серьезные потери при выращивании морских личинок вызваны инфицированием условно-патогенными бактериями, в том числе несколькими членами семейства Vibrionaceae [1], [2], что составляет примерно 1,5% бактериального сообщества в океанах [3].Только около вида Vibrio являются патогенными для организмов, выращиваемых в морской аквакультуре, и одним из наиболее известных патогенов рыб и моллюсков является Vibrio (Listonella) anguillarum , вызывающий серьезные заболевания и смертность [2]. Основным источником патогенных бактерий в морской аквакультуре является питьевая вода [4], но также возможными источниками патогенов являются расплод, люди или заквасочные культуры [5]. Большинство личинок морских рыб интенсивно выращиваются в присутствии микроводорослей (зеленая вода), что улучшает питание, рост и выживаемость личинок [6] — [9].Личинкам нужен живой корм, и коловратки ( Brachionus plicatilis ) обычно используются в качестве первого корма. Сами коловратки питаются или обогащаются живыми микроводорослями, такими как Tetraselmis suecica , Nannochloropsis oculata и Isochrysis galbana . Оппортунистические патогены могут размножаться в личиночных кормовых культурах фитопланктона и беспозвоночных из-за высоких концентраций органического вещества. Таким образом, культуры водорослей, коловраток и артемии могут содержать высокие концентрации патогенных бактерий [1], [5], [10], [11].Профилактическая обработка личинок или их кормовых культур антибиотиками может снизить нагрузку патогенов, но этого следует избегать, поскольку это приводит к появлению устойчивых к антибиотикам патогенов и препятствует созданию нормальной непатогенной микробиоты [1], [12], [13].

Потенциальное использование пробиотических бактерий для ограничения вспышек или последствий бактериальных заболеваний в культурах рыб и беспозвоночных исследуется более двух десятилетий. Большинство исследований сосредоточено на кишечной микробиоте [14] — [19], хотя использование пробиотиков не ограничивается кишечным трактом культивируемых организмов [15], [20].Биотические и абиотические поверхности, водоросли и фекальные частицы, а также богатая питательными веществами вода служат средой обитания и резервуаром условно-патогенных бактерий в культурах личинок рыб или их пищевых организмов [1], [5], [10], [11], [20], и предполагается, что конкуренция со стороны непатогенных бактерий, которые лучше колонизируются и сохраняются в этих средах обитания, может снизить количество патогенных бактерий.

Phaeobacter gallaeciensis (ранее Roseobacter gallaeciensis ) представляет собой грамотрицательную протеобактерию α- из клады Roseobacter [21].Бактерия продуцирует антибактериальное соединение троподитиетиновая кислота (TDA), которая является эффективным ингибитором V. anguillarum и других патогенных для рыб бактерий [22] — [25]. Phaeobacter spp. обычно выделяются из культур личинок морских рыб и моллюсков [26] — [28] и, по-видимому, не оказывают неблагоприятного воздействия на личинок рыб [22], [29]. Ruegeria mobilis , близкий родственник Phaeobacter , также продуцирующий TDA, является космополитической морской бактерией, которую можно изолировать из большинства океанических вод, кроме полярных [30].

В предыдущем исследовании было продемонстрировано, что Phaeobacter и Ruegeria , выделенные из инкубатория камбалы [26], могут уничтожить V. anguillarum в комбинированной системе жидкость-поверхность на основе морской воды [22]. С использованием TDA-отрицательного мутанта было продемонстрировано, что продукция TDA, вероятно, является ключевым фактором ингибирования патогена. Цель настоящего исследования — определить, может ли P. gallaeciensis BS107 (DSM 17395) противодействовать V.anguillarum в личинках рыб и культурах их кормовых организмов. Насколько известно авторам, ни одно исследование антагонистических пробиотических бактерий еще не выяснило механизм действия in vivo . Поэтому неантагонистический TDA-отрицательный мутант P. gallaeciensis BS107 (DSM 17395) был создан для исследования механизма действия in vivo , как подчеркнули Tinh et al . [15]. Был выбран типовой штамм P. gallaeciensis BS107 (DSM17395) [28], поскольку он ингибирует V.anguillarum в культурах Tetraselmis был более выраженным, чем у других штаммов Phaeobacter и Ruegeria , по оценке в предварительном эксперименте (данные не показаны). Гнотобиотические водоросли и коловратки использовались для изучения пробиотических и пищевых эффектов интродуцированного организма в соответствии с рекомендациями [15], [31], [32].

Материалы и методы

Бактериальные штаммы и среды

Все штаммы и плазмиды перечислены в таблице 1. Phaeobacter (Roseobacter) gallaeciensis BS107 (DSM17395) был выделен из морской воды в культурах гребешка ( Pecten maximus ) [28]. Vibrio anguillarum штамм NB10 серотипа O1 был использован в экспериментах с водорослями и коловратками. Он был изолирован в Ботническом заливе и вызвал заболевание у радужной форели [33], [34]. Штамм был помечен вставкой плазмиды pNQFlaC4-gfp27 ( cat , gfp ) в межгенную область на хромосоме и любезно предоставлен D.Милтон, Университет Умео [35]. V. anguillarum серотип O2α HI610 использовали в контрольных испытаниях с личинками трески. Этот штамм был выделен Институтом морских исследований (IMR) Норвегии из больных молоди трески в закрытом бассейне с морской водой озера Парисватн и использовался в контрольных испытаниях с треской [36] — [39]. Он был выбран из группы, состоящей из штаммов V. anguillarum различных серотипов, являющихся штаммом, который вызвал самую высокую смертность в контрольных испытаниях с палтусом, палтусом и личинками трески [40].

Бактерии из замороженных исходных культур (-80 ° C) наносили штрихами на морской агар половинной концентрации (½MA; 27,6 г морского агара Difco 212185, 15 г растворимых морских солей океана, 7,5 г агара, 1 л деионизированной воды). ½MA также использовалось для подсчета P. gallaeciensis . V. anguillarum подсчитывали на триптон-соевом агаре (TSA; Oxoid CM0131), содержащем 6 мг / л хлорамфеникола. Предварительные культуры бактерий для экспериментов с водорослями и коловратками выращивали в 20 мл ½YTSS (2 г экстракта бакто-дрожжей, 1.25 г бакто триптона, 20 г солей Sigma Sea, 1 л деионизированной воды) [41] при 25 ° C с аэрацией (200 об / мин) до OD ₆₀₀ = 1,0. Клетки собирали в количестве 5000 x г , дважды промывали и использовали в качестве инокулята для экспериментов с водорослями и коловратками. Бактерии разбавляли и промывали в искусственной морской воде (ASW; 2% Sigma Sea Salts). Аксеничность культур водорослей и коловраток контролировали, высевая 100 мкл на 1/2 МА и инкубируя в течение 7 дней при 25 ° C.

Для контрольных испытаний, В.anguillarum HI610 выращивали в триптон-соевом бульоне с дополнительным 0,5% NaCl при 20 ° C со встряхиванием при 60 об / мин до OD ₆₀₀ примерно 0,5. Штаммы P. gallaeciensis выращивали в МБ без встряхивания при 20 ° C до достижения стационарной фазы. Все штаммы собирали центрифугированием (1825 x г, ), дважды промывали и ресуспендировали в аэрированной автоклавированной 80% морской воде. Концентрации бактерий в этих суспензиях определяли с помощью счетной камеры для В.anguillarum и для штаммов P. gallaeciensis путем измерения OD ₆₀₀ после центрифугирования и растворения в 0,1 М NaOH.

Получение TDA-отрицательного мутанта

Мутантная библиотека P. gallaeciensis BS107 была создана с помощью мутагенеза случайной вставки транспозонов с использованием набора транспозом EZ-Tn5 Tnp (Epicenter, Madison, WI), следуя процедуре Geng et al . [42]. Были отобраны десять непигментированных мутантов, и отсутствие продукции TDA было подтверждено с помощью UHPLC-TOFMS и в тесте диффузии в агаре против V.anguillarum [27]. Скорости роста выбранных мутантов сравнивали с диким типом в аэрированных (200 об / мин) культурах ½YTSS при 30 ° C, и один из штаммов со скоростью роста, сопоставимой со скоростью роста дикого типа, BS107-Pda8, был выбран для дальнейших экспериментов. Используя спасательное клонирование, как описано в руководстве по набору транспозом, мутировавший локус был идентифицирован как CDS104961, который кодирует «периплазматический компонент транспортной системы C4-дикарбоксилата TRAP-типа», как указано в геноме BS107 на сайте www.roseobase.орг.

Флуоресцентное мечение

P. gallaeciensis BS107 был хромосомно помечен кассетой miniTn7 (Gm) P _{A1 / 04/03} DsRedExpress-a с использованием системы тегирования mini-Tn7 [43], [44]. Доставляющую и вспомогательную плазмиды электропорировали в P. gallaeciensis с последующим отбором на 1/2MA, содержащей 75 мкг / мл гентамицина. pPDA11, транскрипционное слияние промотора tdaC с без промоторного гена gfp , лигированного с плазмидой pRK415 широкого диапазона хозяев, было сконструировано аналогично pHG1011, как описано в Geng et al .2010 [45].

Tetraselmis suecica CCAP 66/4 ( Prasinophyceae ) был получен как аксеническая культура из Коллекции культур водорослей и простейших (Обан, Великобритания). Его культивировали на B-medium [46], минеральной среде для водорослей, основанной на ASW. Бутылки для культивирования на 250 мл закрывали ватными пробками и медленно аэрировали через шприц-фильтр 0,2 мкм и силиконовую трубку для предотвращения оседания частиц. Интенсивность света на бутылках составляла 13000 люкс (дневной спектр).Концентрации водорослей оценивали путем измерения поглощения при 665 нм и калибровки с помощью подсчета аксенических эталонных культур в счетной камере, усовершенствованной по Нойбауэру, с использованием формальдегида в качестве фиксатора (конечная концентрация 0,5%). Для каждого испытанного уровня инокулята V. anguillarum восемь бутылок по 150 мл B-среды инокулировали 6,6 × 10 ⁴ клеток / мл аксеника T. suecica . Два флакона инокулировали примерно 10 ⁷ КОЕ / мл промытого P. gallaeciensis BS107, два флакона с таким же уровнем промытого мутанта P.gallaeciensis BS107-Pda8, и четыре флакона были оставлены аксеническими. Культуры выращивали в течение 2 дней и проверяли аксеничность. Все культуры, за исключением двух аксенических отрицательных контролей, инокулировали V. anguillarum NB10 до концентраций 10, 100, 1000 или 10 ⁴ КОЕ / мл. Уровни посевного материала проверяли подсчетом на чашках. Концентрацию водорослей и обоих видов бактерий наблюдали до 5 дня после инокуляции патогена. Два независимых эксперимента были выполнены для каждой начальной концентрации В.anguillarum . Nannochloropsis oculata CCMP525 ( Eustigmatophyceae ) был получен как аксеническая культура из Центра культуры морского фитопланктона (West Boothbay Harbor, ME). Поскольку он не рос в среде B на основе ASW, его культивировали в среде f / 2 [47] на основе атлантической морской воды, полученной от CCMP. N. oculata культуры не аэрировали. Эксперименты по антагонизму проводили, как и в случае T. suecica , но тестировали только одну исходную концентрацию V. anguillarum (10 ⁴ КОЕ / мл).Были проведены два независимых эксперимента с двумя различными исходными плотностями водорослей (более низкая плотность: 4 × 10 ⁶ клеток / мл, более высокая плотность: 2 × 10 ⁷ клеток / мл).

Анализ TDA

Образцы совместных культур T. suecica — P. gallaeciensis (20 мл) экстрагировали в 50-миллилитровые пробирки с 30 мл этилацетата (степень чистоты для ВЭЖХ), содержащего 1% муравьиную кислоту (степень чистоты для ВЭЖХ), на встряхивающем столе для 1 ч. Образцы центрифугировали при 8000 x г , и 26 мл верхней фазы переносили в новую пробирку Falcon и упаривали досуха при 35 ° C в токе азота.Образцы ресуспендировали в 300 мкл 85% ацетонитрила, встряхивали в течение 5 секунд, помещали в ванну для ультразвуковой обработки на 10 минут, снова встряхивали в течение 5 секунд и фильтровали через стандартный 0,22 мкм шприцевой фильтр PFTE во флакон для ВЭЖХ. Затем подвыборки объемом 2 мкл анализировали с помощью УВЭЖХ-TOFMS на квадрупольном времяпролетном масс-спектрометре maXis G3 (Bruker Daltonics, Бремен, Германия), оборудованном источником ионов с электрораспылением (ESI), который был подключен к системе Ultimate 3000 UHPLC (Dionex, Саннивейл, Калифорния). Разделение проводили при 40 ° C на 100 мм × 2.Внутренний диаметр 1 мм, 2,6 мкм Колонка Kinetex C ₁₈ (Phenomenex, Торранс, Калифорния), оборудованная предварительной колонкой Kinetex, с использованием градиента вода-ацетонитрил (оба забуферены 20 мМ муравьиной кислоты) при потоке 0,4 мл мин. ^-1 , начиная с 10% ацетонитрила и увеличиваясь до 100% за 10 минут, выдерживая это в течение 3 минут. МС работал в ESI ⁺ с диапазоном сбора данных m / z 100–1000 при разрешении 40 000 FMWH, МС был откалиброван с использованием 20 мМ формиата натрия, вводимого перед каждым аналитическим циклом, что обеспечивало точность измерения массы лучше 1 .5 частей на миллион. ТДА детектировали и количественно определяли по хроматограммам экстрагированных ионов [M + H] ⁺ (± m / z 0,001).

Для количественной оценки культур T. suecica были добавлены до конечной концентрации 4800, 2400, 1600, 800, 320, 160 и 0 нМ ТДА (BioViotica, Dransfeld, Германия) путем добавления максимум 80 мкл Раствор TDA-ацетонитрил и обрабатывают, как описано выше. Перед экстракцией образцы с добавками оставляли при комнатной температуре не менее чем на 1 час. Метод был проверен в 3 разных дня с использованием образцов с добавками, как описано, и не было зарегистрировано ни одного ложноположительного или отрицательного результата.Относительное стандартное отклонение составляло 30%, а предел обнаружения был оценен как <50 нМ (сигнал / шум 5∶1) на основе холостых образцов и нижних калибровочных точек. На чувствительность сильно влиял возраст колонки УВЭЖХ, так как TDA оставалась хвостовой (хотя использовалась новая предварительная колонка) на колонках, которые использовались всего несколько недель. Образцы из двух индивидуальных биологических экспериментов анализировали независимо.

Отсутствие TDA в статических культурах TDA-отрицательного мутанта BS107-Pda8 было подтверждено UHPLC-TOFMS анализом.

Антагонизм к Phaeobacter у коловраток, Brachionus plicatilis

Подвой коловратки B. plicatilis (L-тип) был получен от Reed Mariculture (Кэмпбелл, Калифорния). Аксенические коловратки были получены путем дезинфекции приблизительно 50 яиц амиктических коловраток в 1 мл сильного раствора антибиотика (150 мкг / мл тетрациклина, 300 мкг / мл канамицина, 60 мкг / мл хлорамфеникола, 1000 Ед / мл пенициллина в ASW) в течение 2 дней. Вылупившихся коловраток фильтровали через стерильную полиамидную сетку с размером пор 50 мкм, промывали ASW и с этого момента скармливали концентрированным аксеником T.suecica . Никаких экспериментов с N. oculata в качестве корма для коловраток не проводилось, поскольку выживаемость V. anguillarum в присутствии N. oculata была очень изменчивой (см. Раздел «Результаты»). Плотность коловраток определяли путем подсчета в счетной камере Sedgewick-Rafter. Перед подсчетом культуры тщательно перемешивали и к 1 мл образца добавляли 100 мкл 5% формальдегида. Для проведения экспериментов по совместному культивированию культуры аксенных коловраток были разделены на восемь 20-миллилитровых партий в 50-миллилитровых центрифужных пробирках.Начальные концентрации коловраток составляли 94 / мл (первый повтор) и 30 / мл (второй повтор). Для каждого повтора дублированные культуры инокулировали промытым диким типом и мутантом P. gallaeciensis в концентрации приблизительно 5 × 10 ⁷ КОЕ / мл. На следующий день все культуры, кроме аксенических контролей, инокулировали 10 ⁴ КОЕ / мл V. anguillarum . Все культуры коловраток ежедневно получали 10-кратную концентрацию T. suecica (1-2 мл в зависимости от средней плотности коловраток), так что концентрация водорослей после кормления составляла примерно 10 ⁶ клеток / мл и не опускалась ниже 2 × 10 ⁵ клеток / мл.Коловратки подсчитывали ежедневно, определяли концентрации V. anguillarum и P. gallaeciensis и проверяли аксеничность отрицательных контролей. Образцы культур коловраток для подсчета бактерий гомогенизировали измельчением и повторным пипетированием через наконечник пипетки на 100 мкл. Это сравнивали с гомогенизацией с помощью Ultra-Turrax T25 (IKA, Германия) при 16000 об / мин, и не было обнаружено значительных различий в количестве бактерий (P = 0,74).

Пробное испытание

Протокол был адаптирован из [39], [40].Эмбрионы трески ( Gadus morhua ) были получены из коммерческого инкубатория Havlandet AS во Флорё, Западная Норвегия. Транспортировка эмбрионов в контейнерах из полистирола при температуре около 8 ° C заняла в общей сложности от 4 до 5 часов на лодке и автомобиле. Были проведены две независимые повторы испытания с заражением. Эмбрионы, использованные в первом испытании, были продезинфицированы баффодином (Evans Vanodine, Престон, Великобритания), эмбрионы для второго испытания остались без лечения. По прибытии эмбрионы были случайным образом отобраны и распределены в лунки 24-луночных чашек (Nunc, Роскилле, Дания), заполненных 2 мл 80% автоклавированной аэрированной морской воды, помещая по одному эмбриону в каждую лунку.В каждом испытании готовили по три чашки для каждой обработки (72 эмбриона) и сразу же инокулировали. Шесть групп обработки перечислены в таблице 2. Все инокуляты были приготовлены в объеме 100 мкл, и штаммы не смешивались перед инокуляцией. Исходные бактериальные концентрации составляли 1 × 10 ⁶ КОЕ / мл для V. anguillarum HI610 и около 10 ⁷ КОЕ / мл для штаммов P. gallaeciensis . Планшеты инкубировали в темноте при 7 ° C. День, когда вылупилось 50% личинок, был определен как день 0, то есть через 6 дней после начала эксперимента.Ежедневно в течение 14 дней регистрировали погибших личинок.

Статистика

Различия между концентрациями бактерий или водорослей оценивали с помощью дисперсионного анализа с повторными измерениями после логарифмической трансформации. Для попарных сравнений использовался критерий множественного сравнения Тьюки. Чтобы устранить влияние присутствия P. gallaeciensis на концентрации V. anguillarum , исходные значения (день 0) не учитывались в анализе, и эксперименты анализировались отдельно. Перед применением дисперсионного анализа числа коловраток не преобразовывались в логарифм, и исходные значения не указывались.Количество P. gallaeciensis и методы гомогенизации сравнивали с использованием парных t-критериев после логарифмического преобразования.

Совокупную смертность в испытаниях с заражением сравнивали на 10-й день, до наступления голодания к концу эксперимента. Был реализован тест хи-квадрат для 2 ² таблиц сопряженности с использованием программного обеспечения R, версия 2.13.1 (R Foundation for Statistical Computing, Вена, Австрия).

Результаты

Антагонизм в культурах водорослей

Как дикий тип, так и мутант P.gallaeciensis колонизировал культуры T. suecica и N. oculata . В культурах T. suecica P. gallaeciensis достигло 10 ⁷ КОЕ / мл (рис. 1). В плотных культурах N. oculata , P. gallaeciensis концентрации составляли приблизительно 5 × 10 ⁶ КОЕ / мл, а в менее плотных культурах — приблизительно 8 × 10 ⁵ КОЕ / мл (Рисунок S1). Дикий тип Phaeobacter достиг немного большего числа у T.suecica , чем TDA-отрицательный мутант (P = 0,0211). Такое же небольшое различие было замечено в одном из двух экспериментов Nannochloropsis (P = 0,0335, P = 0,9259). P. gallaeciensis не влиял на рост водорослей T. suecica (P = 0,9977) и N. oculata (P = 0,9919). Частицы, состоящие из мертвых T. suecica и клеточных стенок водорослей, которые были сброшены во время деления клеток, служили средой обитания для розетки, образующей P. gallaeciensis , которая образовывала плотные биопленки на частицах (Рисунок 2 A – D).

Рис. 1. Концентрации Tetraselmis suecica и Phaeobacter gallaeciensis в совместных культурах.

Средние значения и стандартные отклонения восьми экспериментов: колониеобразующие единицы P. gallaeciensis дикого типа (♦) и TDA-отрицательный мутант (•) и концентрации T. suecica с V. anguillarum ( ▾), T. suecica с P. gallaeciensis дикого типа (▪), T. suecica с P.gallaeciensis TDA-отрицательный мутант () и аксенический T. suecica (□). Штаммы P. gallaeciensis были инокулированы с концентрацией 10 ⁷ КОЕ / мл и оставались стабильной популяцией, в то время как водоросли перешли из поздней логарифмической фазы в стационарную фазу.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043996.g001

Рисунок 2. Локализация бактерий в культурах Tetraselmis suecica .

Фазово-контрастные (A, C) и флуоресцентные (B, D, E) микрофотографии.Совместное культивирование Tetraselmis suecica с Phaeobacter gallaeciensis dsRed (A, B), аксеническое T. suecica (C, D), совместное культивирование T. suecica с V. anguillarum gfp. ). На панелях A и B показаны две одиночные (слева) и одна делящаяся водорослевая клетка (справа), а также морская снежно-подобная частица, состоящая из остатков водорослей, которая заселена красными флуоресцентными P. gallaeciensis . Красная флуоресценция водорослей обусловлена ​​хлорофиллом. Панели C и D показывают водорослевую клетку и частицы из аксенической культуры, записанные с использованием тех же настроек, что и для панелей выше.На панели E показаны красно-флуоресцентные клетки водорослей и зеленые флуоресцентные V. anguillarum , которые не колонизируют частицы, а остаются в суспензии в виде отдельных подвижных клеток.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043996.g002

V. anguillarum эффективно колонизировал все культуры Tetraselmis , которые не были инокулированы P. gallaeciensis , и их количество увеличилось до 2,7 log единиц в течение первого дня (рис. 3, рис. S2) и достигла в среднем 3 × 10 ⁶ КОЕ / мл через 5 дней. V. anguillarum не колонизировал частицы в культурах водорослей, но оставался в суспензии (рис. 2 E). Количество V. anguillarum заметно уменьшалось в присутствии P. gallaeciensis дикого типа (фиг. 3, фиг. S2). Снижение Vibrio было порядка 3 логарифмических единиц по сравнению с моноксенными контролями только с V. anguillarum , а полное устранение самого низкого посевного материала Vibrio было достигнуто в 3 из 4 повторов (рис. 3A).Эффекты дикого типа P. gallaeciensis на V. anguillarum были очень значимыми во всех экспериментах Tetraselmis по сравнению с контролем (P <0,001) и мутантом (P <0,001). Присутствие TDA-отрицательного мутанта действительно уменьшало концентрацию патогена примерно на одну логарифмическую единицу, хотя это было значимо только (α = 0,05) для двух из исходных концентраций Vibrio (10 ¹ : P = 0,0518, 10 ² : P = 0,0011, 10 ³ : P = 0.0517, 10 ⁴ : P = 0,0008).

Рисунок 3. Уменьшение V. anguillarum в культурах Tetraselmis suecica с помощью Phaeobacter gallaeciensis .

Колониеобразующие единицы V. anguillarum , инокулированные при 10 ¹ КОЕ / мл (A) и 10 ⁴ КОЕ / мл (B) в присутствии P. gallaeciensis дикого типа (▪), в присутствии TDA-отрицательного мутанта P. gallaeciensis () и в моноксенном контроле ().

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043996.g003

Заметное различие в ингибировании V. anguillarum диким типом P. gallaeciensis и отрицательным мутантом TDA предполагает, что TDA является основным эффектором. молекула. Однако TDA не был обнаружен химическим анализом совместных культур Phaeobacter – Tetraselmis , где каждая из трех повторностей культур была проанализирована в трех повторностях с пределом обнаружения <50 нМ TDA. Эксперимент и анализ были повторены с тем же результатом.Чтобы определить, действительно ли дикий тип продуцирует TDA в культурах водорослей, P. gallaeciensis , несущий pPDA11 ( tdaCp :: gfp ), культивировали совместно с T . suecica. Промотор tdaC , свидетельствующий о продукции TDA, был индуцирован при выращивании на частицах в культуре T. suecica , на что указывает флуоресценция Gfp (фиг. 4). Добавление чистого TDA к культурам Tetraselmis , инокулированным V. anguillarum , привело к полному уничтожению популяции Vibrio , но также повлияло на выживаемость водорослей (50 мкМ TDA).Более низкая концентрация в 50 раз (1 мкМ) не оказала влияния на водоросли, но временно снизила уровень V. anguillarum ниже 10 КОЕ / мл. Концентрация 50 нМ TDA, которая была пределом обнаружения химического анализа, не имела никакого эффекта (данные не показаны).

Фиг.4. Экспрессия tdaC при совместном культивировании с Tetraselmis suecica .

Фазово-контрастные (A) и флуоресцентные (B) микрофотографии P. gallaeciensis pPDA11 ( tdaCp :: gfp ) в совместном культивировании с T.suecica . На двух панелях показаны одни и те же семь водорослевых клеток, некоторые из которых деляются, и морская снежно-подобная частица, которая колонизируется P. gallaeciensis , несущим слияние промотора на плазмиде. Зеленая флуоресценция P. gallaeciensis на частице показывает, что ген gfp экспрессируется с промотора tdaC, что указывает на продукцию TDA.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043996.g004

V. anguillarum был полностью элиминирован в культурах Nannochloropsis oculata дикого типа P.gallaeciensis в течение одного или двух дней (рисунок S3). Однако V. anguillarum мог существовать только в плотных культурах N. oculata . В менее плотных культурах N. oculata V. anguillarum исчезли из моноксенного контроля в течение 3 дней. Следовательно, влияние дикого типа P. gallaeciensis на V. anguillarum по сравнению с контролем было значительным в эксперименте с высокой плотностью водорослей (P = 0,001), но не с низкой плотностью (P = 0). .2106).

Антагонизм в культурах коловраток

Концентрация P. gallaeciensis и его мутанта в культурах коловраток была стабильной и составляла примерно 10 ⁶ –10 ⁷ КОЕ / мл, и не наблюдалось значительной разницы между двумя штаммами (P = 0,3689). Коловратки росли быстрее и достигли более высокой плотности в присутствии P. gallaeciensis , чем в аксеническом или моноксенном ( V. anguillarum ) контроле (P <0,05) (Рисунок 5, Рисунок S4).Дикий тип P. gallaeciensis снизил концентрацию V. anguillarum на 3 log единицы (P <0,01), в среднем с 6 × 10 ⁵ до 9 × 10 ² КОЕ / мл (рис. 6). Влияние TDA-отрицательного мутанта на концентрацию патогена было незначительным (P> 0,05).

Рисунок 5. Влияние штаммов бактерий на рост коловраток.

Число коловраток в совместном культивировании с P. gallaeciensis дикого типа (▾), с TDA-отрицательным мутантом P.gallaeciensis (♦), только с V. anguillarum (▴) и аксеническими коловратками (▪), первый эксперимент. Все бактерии были инокулированы в день 0. Оба штамма P. gallaeciensis способствовали росту коловраток, тогда как V. anguillarum не влияли.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043996.g005

Рис. 6. Уменьшение Vibrio anguillarum на Phaeobacter gallaeciensis в культурах коловраток.

Средние значения двух повторных опытов: колониеобразующие единицы В.anguillarum в совместном культивировании с P. gallaeciensis дикого типа (), с TDA-отрицательным мутантом P. gallaeciensis () и в моноксенном контроле (▪).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043996.g006

Пробное испытание

Через шесть дней после прибытия эмбрионов и инокуляции более 50% личинок вылупились. Общий совокупный успех вылупления составил 79,2% (первое испытание 79,6% и второе испытание 78,7%). Первоначальная смертность была ниже в первом испытании (16.6%), чем во втором (24,8%). В не зараженном и необработанном контроле 34,7% ± 9,8% (среднее ± стандартное отклонение) личинок погибли к 1-му дню, однако после начальной смертности только 2,8% ± 0% личинок погибли между 2-м и 2-м днями. на 10-й день, достигая к 10-му дню совокупной смертности 37,5% ± 9,8%. Личинки, зараженные V. anguillarum HI610, быстро погибли и достигли накопленной смертности 100% ± 0%. Обработка личинок Vibrio дикого типа P. gallaeciensis вызвала значительное снижение накопленной смертности к 10–12-му дню.5% ± 2,0%, что было не только ниже, чем у зараженных личинок, но и ниже, чем у не зараженных (37,5%). 96,1% ± 1,1% вылупившихся личинок, которые получили P. gallaeciensis дикого типа , дожили до 10-го дня, когда наступил голод (Рисунок 7, Рисунок S5). Личинки, подвергшиеся воздействию только P. gallaeciensis дикого типа или мутанта, имели кумулятивную смертность 12,1% ± 3,1% на 10-й день. TDA-отрицательный мутант P. gallaeciensis действительно снизил совокупную смертность зараженных личинок до 68.8% ± 30,4% (рис. 7, рис. S5), но не был таким эффективным, как дикий тип, продуцирующий TDA.

Рис. 7. Смертность личинок трески во время контрольных испытаний.

Средние значения двух независимых трехкратных экспериментов. Культуры одиночных личинок одновременно инокулировали P. gallaeciensis дикого типа и V. anguillarum (T5, •) или TDA-отрицательным мутантом P. gallaeciensis и V. anguillarum (T6, □). Необработанные личинки и личинки, подвергшиеся воздействию отдельных штаммов бактерий, выступали в качестве контроля: отрицательный контроль (T1, ▪), только V.anguillarum (T2, ▴), только P. gallaeciensis дикого типа (T3,) и только P. gallaeciensis TDA-отрицательный мутант (T4, ♦).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043996.g007

Обсуждение

Настоящее исследование демонстрирует, что Phaeobacter gallaeciensis безвреден и полезен для трески на ранних этапах жизни. Не менее важно, что P. gallaeciensis очень эффективен в предотвращении инфекций, вызванных V.anguillarum , и этот пробиотический эффект может быть достигнут при низкой температуре (7 ° C), используемой для эмбрионов трески и личинок желточного мешка. Ранее было продемонстрировано, что Phaeobacter sp. может защитить личинок камбалы от вибриоза при более высоких температурах (18 ° C) [29]. Неинфицированные личинки показали некоторый уровень исходной смертности, которая могла быть связана с оппортунистическими бактериями, занесенными с эмбрионами. Как зараженные, так и необработанные личинки трески, подвергшиеся воздействию P. gallaeciensis , имели значительно более низкую исходную смертность, что указывает на то, что естественная микробиота хориона может контролироваться пробионтом.

Ключевым вопросом при использовании пробиотиков в аквакультуре является то, как и где пробионт следует вводить в систему. В нескольких исследованиях подчеркивалась потенциальная роль кормовых организмов как носителя для пробиотических бактерий [29], [48] — [51] или способность пробиотических бактерий контролировать патогенные бактерии в кормовых культурах [51] — [53]. Большинство исследований были сосредоточены на кишечных пробиотических бактериях и были направлены на улучшение здоровья либо выращиваемых животных, либо кормовых организмов.Напротив, в настоящем исследовании используется системный подход к предотвращению бактериальных заболеваний организмов аквакультуры, направленный на микробный контроль во всей среде выращиваемого организма и на более низких трофических уровнях продукции. Здесь было обнаружено, что культуры двух водорослей, имеющих отношение к аквакультуре, и коловратки B. plicatilis могут быть колонизированы P. gallaeciensis без ущерба для их роста, и что P. gallaeciensis в этих культурах будет сильно уменьшать или устранить рыб-патогенные В.anguillarum . Введение P. gallaeciensis на этом трофическом уровне очень многообещающе, поскольку живой корм является обычным источником условно-патогенных микроорганизмов [1], [5], [10], [11]. Эти результаты подтверждают гипотезу предыдущего исследования о том, что водоросли и коловратки в аквакультуре можно культивировать вместе с пробиотиком Roseobacters и, таким образом, предотвратить распространение патогенов [22]. Редукция патогенного возбудителя Vibrio sp. на 3 логарифмических единицы, как это было достигнуто в настоящем исследовании, является очень многообещающим с точки зрения укрепления здоровья личинок, поскольку только одно логарифмическое снижение бактериальной нагрузки у коловраток с помощью УФ-излучения привело к более высокой выживаемости личинок камбалы [54].Использование пробиотических бактерий по сравнению с УФ-обработкой дает то преимущество, что питательные вещества потребляются, ниши заняты, и предотвращается быстрый повторный рост патогенов. Следует отметить, что настоящее исследование было проведено с использованием систем гнотобиотиков, чтобы исключить влияние микробиоты, присущей водорослям и культурам коловраток. Таким образом, невозможно определить, повлияет ли P. gallaeciensis и в какой степени на внутренние микробные сообщества культур водорослей и коловраток.

Торможение В.anguillarum с помощью Phaeobacter sp. в модельной аквакультуре уже однажды изучались: Planas et al . [29] продемонстрировали, что смертность личинок камбала, инфицированных V. anguillarum , может быть снижена за счет Phaeobacter sp. 27-4. Использовали дублирующую установку резервуара, и патоген, и пробионт помещали в коловратки и скармливали личинкам. Несмотря на доставку с кормом, пробионт был обнаружен только в просвете личиночной кишки и не колонизировал кишечный эпителий.В отличие от этого, настоящее исследование не нацелено на пробиотический эффект в кишечном тракте личинок, а оценивает потенциал Phaeobacter для устранения патогена в среде личинок или эмбрионов. Следует отметить, что, поскольку личинки начинают пить вскоре после вылупления [55], в кишечнике могут встречаться патогены и пробионты. Phaeobacter sp. 27-4 является продуцентом TDA, однако, в отличие от P. gallaeciensis BS107, он продуцирует TDA только в застойной культуре [26], что позволяет предположить, что его продукция TDA может быть более ограничена и что BS107 может быть более антагонистическим в vivo .

В испытании контрольного заражения TDA-отрицательный мутант снижал исходную смертность так же эффективно, как и мутант дикого типа, но не мог предотвратить инфекцию у большинства личинок. Пробиотический эффект мутанта можно объяснить конкуренцией за питательные вещества, пространство или другие ресурсы или прямым иммуностимулирующим действием на личинок [56] — [59]. Мутировавший ген, который делает P. gallaeciensis BS107-Pda8 неспособным продуцировать TDA, принадлежит оперону, кодирующему части транспортного белка, который, как еще не сообщалось, участвует в производстве TDA [42].Роль этого трансмембранного белка в продукции TDA не исследовалась. Нельзя исключить, что эта мутация имеет плейотропные фенотипические эффекты, и другие функции, помимо продукции TDA, могут быть затронуты и могут повлиять на антагонистические свойства Phaeobacter gallaeciensis . Тем не менее, эксперимент с использованием чистого TDA показал, что это соединение действительно оказывает сильное ингибирующее действие против V. anguillarum в системе водорослей.

Различие в антагонизме Vibrio между TDA-отрицательным мутантом и диким типом предполагает, что продукция TDA является признаком, обеспечивающим P.gallaeciensis , чтобы противостоять V. anguillarum . Однако TDA не был обнаружен химическим анализом совместных культур Phaeobacter-Tetraselmis . Поскольку слияние tdaC с промотором ( tdaCp :: gfp ) продемонстрировало, что tdaC экспрессируется P. gallaeciensis в частицах в культурах водорослей, причина отсутствия химического обнаружения может заключаться в том, что концентрация TDA достигает ингибирующих концентраций только в Phaeobacter -колонизированных частицах.ТДА, вероятно, концентрируется внутри и вокруг частиц, прилипает к органической массе частицы или удерживается внутри EPS, производимого P. gallaeciensis . С экологической точки зрения, для морской бактерии, связанной с частицами, производство антагонистического соединения было бы более эффективным, если бы соединение не было диспергировано, а хранилось в непосредственной близости от возможных конкурентов.

Хотя TDA-продуцирующие Phaeobacter и Ruegeria spp.вероятно, уже присутствуют в системах выращивания личинок, их антагонистические свойства, которые могут зависеть от условий роста, вероятно, отличаются от P. gallaeciensis BS107 [22], [26]. Предварительный эксперимент этого исследования показал, что только некоторые из протестированных штаммов Phaeobacter и Ruegeria были антагонистами в культурах T. suecica , тогда как все они учитывали большие зоны ингибирования в анализах на агаровой основе. Таким образом, интродукция P.gallaeciensis BS107 в культурах водорослей и коловраток, вероятно, повысит выживаемость личинок, даже если другие Roseobacters уже присутствуют в системе. Его стимулирующий рост эффект на коловраток может дать неожиданное дополнительное преимущество. Неизвестно, связано ли это с питательной ценностью бактерий или с их потенциальной ролью в кишечнике коловраток. В настоящем исследовании на рост коловраток не повлиял V. anguillarum . Тем не менее, штамм V. anguillarum , как сообщается, вызывает выраженное ингибирование роста коловраток при неоптимальных схемах кормления [60], что, возможно, можно исправить с помощью P.gallaeciensis .

Невозможно предсказать, будут ли и как другие патогены в водорослях и культурах коловраток подавляются P. gallaeciensis , однако ряд патогенов рыб подавляется in vitro P. gallaeciensis [22], [25] ], что указывает на то, что он, вероятно, может защитить от других патогенов, кроме V. anguillarum . Порсби и др. . [61] рассмотрели опасения, что устойчивость к TDA может развиваться, и с помощью нескольких экспериментальных подходов обнаружили, что устойчивые мутанты или варианты не могут быть выделены ни из культур краткосрочной селекции, содержащих различные концентрации TDA, ни в результате долгосрочной адаптации. культуры (> 300 поколений), содержащие увеличивающиеся концентрации TDA.

Недавнее исследование показало, что P. gallaeciensis при инкубации с п-кумаровой кислотой продуцировал сильнодействующие альгициды, розеобактины, которые были эффективны против различных микроводорослей, среди которых T. suecica [62]. П-кумаровая кислота — продукт распада лигнина, который содержится не только в наземных растениях, но и в водорослях. Получение альгицидов было возможно только при концентрациях п-кумаровой кислоты выше 0,4 мМ. Авторы предположили, что P.gallaeciensis способствует здоровью и росту водорослей, выделяя ТДА и фенилуксусную кислоту, но производит альгициды в присутствии п-кумарата, который является индикатором старения водорослей, чтобы использовать биомассу водорослей для собственного роста [62]. Однако в настоящем исследовании не наблюдалось отрицательного воздействия P. gallaeciensis на рост водорослей. Возможно, уровни п-кумаровой кислоты в культурах микроводорослей были слишком низкими для производства розеобактицида. Экологическая экологическая ниша P.gallaeciensis еще не описан, хотя исследования Rao et al . [63] — [65] указывают на то, что он предпочитает поверхность макроводорослей, которые во время их разложения могут объяснять более высокие локальные концентрации п-кумаровой кислоты, чем микроводоросли. На аквакультурной ферме Phaeobacter spp. было обнаружено, что они «естественным образом» встречаются на твердых поверхностях, тогда как только Ruegeria spp. были изначально связаны с культурами водорослей [26].

На основании представленных данных предполагается, что P.gallaeciensis может использоваться в морском культивировании личинок в качестве средства борьбы с потенциально опасной микробиотой окружающей среды в культурах коловраток и микроводорослей, а также в качестве профилактики вибриоза у личинок рыб.

Вспомогательная информация

Рисунок S1.

Концентрации Nannochloropsis oculata и Phaeobacter gallaeciensis в совместных культурах. Колониеобразующие единицы P.gallaeciensis дикого типа (•) и TDA-отрицательного мутанта (□), а также концентрации N. oculata с V. anguillarum (▴), N. oculata с P. gallaeciensis дикого типа (▾ ), N. oculata с P. gallaeciensis TDA-отрицательным мутантом (♦) и аксеническим N. oculata (▪) в плотных (A) и менее плотных (B) культурах.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043996.s001

(TIF)

Рисунок S2.

Уменьшение Vibrio anguillarum на Phaeobacter gallaeciensis в культурах Tetraselmis suecica . Колониеобразующие единицы V. anguillarum , инокулированные при 10 ² КОЕ / мл (A) и 10 ³ КОЕ / мл (B) в присутствии P. gallaeciensis дикого типа (▪), в наличие TDA-отрицательного мутанта P. gallaeciensis () и в моноксенном контроле ().

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043996.s002

(TIF)

Рисунок S3.

Снижение Vibrio anguillarum на Phaeobacter gallaeciensis в культурах Nannochloropsis oculata . Колониеобразующие единицы V. anguillarum в присутствии P. gallaeciensis дикого типа (▴), в присутствии P.gallaeciensis TDA-отрицательный мутант (▾), а в моноксенном контроле (▪) в плотном (3 × 10 ⁷ клеток / мл; A) и менее плотном (1–7 × 10 ⁶ клеток / мл; Б) культуры N. oculata .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043996.s003

(TIF)

Рисунок S4.

Влияние штаммов бактерий на рост коловраток. Число коловраток в совместном культивировании с P. gallaeciensis дикого типа (▾), с TDA-отрицательным мутантом P.gallaeciensis (♦), только с V. anguillarum (▴) и аксеническими коловратками (▪), второй эксперимент. Все бактерии были инокулированы в день 0. Оба штамма P. gallaeciensis способствовали росту коловраток, тогда как V. anguillarum не влияли.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043996.s004

(TIF)

Рисунок S5.

Смертность личинок трески во время контрольных испытаний. Средние значения двух независимых трехкратных экспериментов с планками ошибок, указывающими на стандартные отклонения.Культуры одиночных личинок одновременно инокулировали P. gallaeciensis дикого типа и V. anguillarum (T5, •) или TDA-отрицательным мутантом P. gallaeciensis и V. anguillarum (T6, □). Неоткрытые личинки и личинки, подвергшиеся воздействию отдельных штаммов бактерий, выступали в качестве контроля: отрицательный контроль (T1, ▪), только V. anguillarum (T2, ▴), только P. gallaeciensis дикого типа (T3, ▾) и только P. gallaeciensis TDA-отрицательный мутант (T4, ♦).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043996.s005

(TIF)

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Дебру Милтон из Университета Умео за предоставление хромосомно-меченного Vibrio anguillarum NB10. Мы также благодарим Пола Хеннинга Левика за помощь в проведении экспериментов.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: PD SL HIW KFN ØB LG. Проведены эксперименты: PD SL MJP KFN HIW ØB.Проанализированы данные: PD SL KFN HIW ØB LG. Написал бумагу: PD LG.

Список литературы

1. 1. Олафсен Дж. А. (2001) Взаимодействие между личинками рыб и бактериями в морской аквакультуре. Aquacult 200: 223–247.
2. 2. Торанцо А.Е., Магаринос Б., Ромальде Дж.Л. (2005) Обзор основных 3. бактериальных болезней рыб в системах марикультуры. Aquacult 246: 37–61.
3. 3. Wietz M, Gram L, Jorgensen B, Schramm A (2010) Широтные закономерности численности основных групп морского бактериопланктона.Aquat Microb Ecol 61: 179–189.
4. 4. Дуйе П.А., Пикеринг П.Л. (1999) Обработка морской водой для выращивания личинок рыб Sciaenops ocellatus Linnaeus (красный барабан). Aquacult 170: 113–126.
5. 5. Эдди С.Д., Джонс С.Х. (2002) Микробиология выращивания летней камбалы Paralichthys dentatus на заводе по выращиванию морской рыбы. Aquacult 211: 9–28.
6. 6. Salvesen I, Reitan KI, Skjermo J, Oie G (2000) Микробная среда в морском выращивании личинок: влияние скорости роста водорослей на бактериальную нагрузку в шести микроводорослях.Aquacult Int 8: 275–287.
7. 7. Conceicao LEC, Юфера М., Макридис П., Мораис С., Динис М. Т. (2010) Живые корма для ранних стадий выращивания рыбы. Исследования аквакультуры 41: 613–640.
8. 8. Naas KE, Naess T, Harboe T (1992) Улучшенное 1-е кормление личинок палтуса ( Hippoglossus hippoglossus, л) в зеленой воде. Aquacult 105: 143–156.
9. 9. Skjermo J, Vadstein O (1999) Методы микробного контроля при интенсивном выращивании морских личинок.Aquacult 177: 333–343.
10. 10. Munro PD, Barbour A, Birkbeck TH (1995) Сравнение роста и выживаемости личинок тюрбата в отсутствие культивируемых бактерий с бактериями в присутствии Vibrio anguillarum , Vibrio alginolyticus , или A Marine Aeromonas Sp. Appl Environ Microbiol 61: 4425–4428.
11. 11. Reid HI, Treasurer JW, Adam B, Birkbeck TH (2009) Анализ бактериальных популяций в кишечнике развивающихся личинок трески и идентификация Vibrio logei , Vibrio anguillarum и Vibrio splendidus как возбудителей личинок трески.Aquacult 288: 36–43.
12. 12. Cabello FC (2006) Интенсивное использование профилактических антибиотиков в аквакультуре: растущая проблема для здоровья человека и животных, а также для окружающей среды. Env Microbiol 8: 1137–1144.
13. 13. Skjermo J, Salvesen I, Oie G, Olsen Y, Vadstein O (1997) Вода, созревшая на микробах: метод отбора неопортунистической бактериальной флоры в воде, которая может улучшить продуктивность морских личинок. Aquacult Int 5: 13–28.
14. 14. Vine NG, Leukes WD, Kaiser H (2006) Пробиотики в морском гусенице.FEMS Microb Rev 30: 404–427.
15. 15. Tinh NTN, Dierckens K, Sorgeloos P, Bossier P (2008) Обзор функциональности пробиотиков в пищевой цепи личинок. Mar Biotechnol 10: 1–12.
16. 16. Ван Ю.Б., Ли Дж. Р., Линь Дж. Д. (2008) Пробиотики в аквакультуре: проблемы и перспективы. Aquacult 281: 1–4.
17. 17. Kesarcodi-Watson A, Kaspar H, Lategan MJ, Gibson L (2008) Пробиотики в аквакультуре: необходимость, принципы и механизмы действия и процессы скрининга.Aquacult 274: 1–14.
18. 18. Ирианто А., Остин Б. (2002) Пробиотики в аквакультуре. J? Fish Dis 25: 633–642.
19. 19. Balcazar JL, de Blas I, Ruiz-Zarzuela I, Cunningham D, Vendrell D, et al. (2006) Роль пробиотиков в аквакультуре. Ветеринарная микробиология 114: 173–186.
20. 20. Verschuere L, Rombaut G, Sorgeloos P, Verstraete W (2000) Пробиотические бактерии как агенты биологической борьбы в аквакультуре. Microbiol Mol Biol Rev 64: 655–671.
21. 21. Мартенс Т., Хайдорн Т., Пукалл Р., Саймон М., Тиндалл Б.Дж. и др. (2006) Реклассификация Roseobacter gallaeciensis Ruiz-Ponte, et al. 1998 как Phaeobacter gallaeciensis gen. нов., гребешок. nov., описание Phaeobacter ignens sp nov., реклассификация Ruegeria algicola (Lafay, et al. 1995) Uchino, et al. 1999 как Marinovum algicola gen. нов., гребешок. nov., и исправленные описания родов Roseobacter , Ruegeria и Leisingera .Международный журнал систематической и эволюционной микробиологии 56: 1293–1304.
22. 22. D’Alvise PW, Melchiorsen J, Porsby CH, Nielsen KF, Gram L (2010) Инактивация Vibrio anguillarum прикрепленными и планктонными клетками Roseobacter . Appl Environ Microbiol 76: 2366–2370.
23. 23. Брун Дж. Б., Нильсен К. Ф., Хьельм М., Хансен М., Брешиани Дж. И др. (2005) Экология, ингибирующая активность и морфогенез морской антагонистической бактерии, принадлежащей к кладе Roseobacter .Appl Environ Microbiol 71: 7263–7270.
24. 24. Брун Дж. Б., Грам Л., Белас Р. (2007) Производство антибактериальных соединений и формирование биопленок видами Roseobacter На видов влияют условия культивирования. Appl Environ Microbiol 73: 442–450.
25. 25. Prado S, Montes J, Romalde JL, Barja JL (2009) Ингибирующая активность штаммов Phaeobacter против патогенных бактерий аквакультуры. Int Microbiol 12: 107–114.
26. 26. Porsby CH, Nielsen KF, Gram L (2008) Phaeobacter и Ruegeria вида клады Roseobacter колонизируют отдельные ниши в датской тюрбо ( Scophthalmus maximus ), выращивающей ферму, и противодействуют 1492 разному росту Vibrio условия.Appl Environ Microbiol 74: 7356–7364.
27. 27. Hjelm M, Bergh O, Riaza A, Nielsen J, Melchiorsen J и др. (2004) Селекция и идентификация автохтонных потенциальных пробиотических бактерий из личинок камбала ( Scophthalmus maximus ), выращивающих особи. Syst Appl Microbiol 27: 360–371.
28. 28. Ruiz-Ponte C, Cilia V, Lambert C, Nicolas JL (1998) Roseobacter gallaeciensis sp. nov., новая морская бактерия, выделенная из выращиваний и собирателей гребешка Pecten maximus .Инт? J? Системный бактериол 48: 537–542.
29. 29. Planas M, Perez-Lorenzo M, Hjelm M, Gram L, Fiksdal IU и др. (2006) Пробиотический эффект in vivo Roseobacter штамма 27-4 против Vibrio ( Listonella ) anguillarum , инфицированных личинками камбала ( Scophthalmus maximus L.). Aquacult 255: 323–333.
30. 30. Грам Л., Мельхиорсен Дж., Брюн Дж. Б. (2010) Антибактериальная активность морских культивируемых бактерий, собранных из глобального отбора проб поверхностных вод океана и поверхностных мазков морских организмов.Mar Biotechnol 12: 439–451.
31. 31. Tinh NTN, Phuoc NN, Dierckens K, Sorgeloos P, Bossier P (2006) Гнотобиотически выращенная коловратка Brachionus plicatilis sensu strictu как инструмент для оценки микробных функций и питательной ценности различных типов пищи. Aquacult 253: 421–432.
32. 32. Мартинес-Диас С.Ф., Варес-Гонсалес К.А., Легоррета М.М., Васкес-Хуарес Р., Барриос-Гонсалес Дж. (2003) Устранение ассоциированного микробного сообщества и биоинкапсуляция бактерий в коловратке Brachionus plicatilis .Aquacult Int 11: 95–108.
33. 33. Norqvist A, Norrman B, Wolfwatz H (1990) Идентификация и характеристика металлопротеиназы цинка, связанной с инвазией патогена рыб Vibrio anguillarum . Заражение иммунной 58: 3731–3736.
34. 34. Norqvist A, Hagstrom A, Wolfwatz H (1989) Защита радужной форели от вибриоза и фурункулеза с помощью ослабленных штаммов Vibrio anguillarum . Appl Environ Microbiol 55: 1400–1405.
35. 35. Croxatto A, Lauritz J, Chen C, Milton DL (2007) Vibrio anguillarum для колонизации покровов радужной форели требуется локус ДНК, участвующий в транспорте и биосинтезе экзополисахаридов. Env Microbiol 9: 370–382.
36. 36. Samuelsen OB, Bergh O (2004) Эффективность перорального приема флорфеникола и оксолиновой кислоты для лечения вибриоза трески ( Gadus morhua ). Aquacult 235: 27–35.
37. 37. Vik-Mo FT, Bergh O, Samuelsen OB (2005) Эффективность перорального введения флумекина при лечении вибриоза, вызванного Listonella anguillarum у атлантической трески Gadus morhua.Dis Aquat Org 67: 87–92.
38. 38. Seljestokken B, Bergh O, Melingen GO, Rudra H, Olsen RH и др. (2006) Лечение экспериментально индуцированного вибриоза ( Listonella anguillarum ) трески Gadus morhua L. с помощью флорфеникола. Журнал болезней рыб 29: 737–742.
39. 39. Sandlund N, Bergh O (2008) Скрининг и характеристика потенциально патогенных бактерий, связанных с личинками атлантической трески Gadus morhua : испытания в ванне с использованием системы с несколькими чашками.Dis Aquat Org 81: 203–217.
40. 40. Sandlund N, Rodseth OM, Knappskog DH, Fiksdal IU, Bergh O (2010) Сравнительная восприимчивость личинок камбалы, палтуса и желточного мешка трески к заражению Vibrio spp. Dis Aquat Org 89: 29–37.
41. 41. Sobecky PA, Mincer TJ, Chang MC, Helinski DR (1997) Плазмиды, выделенные из микробных сообществ морских отложений, содержат области репликации и несовместимости, не связанные с таковыми из известных групп плазмид. Appl Environ Microbiol 63: 888–895.
42. 42. Geng HF, Bruhn JB, Nielsen KF, Gram L, Belas R (2008) Генетическое вскрытие биосинтеза троподитиетиновой кислоты морскими розеобактерами. Appl Environ Microbiol 74: 1535–1545.
43. 43. Lambertsen L, Sternberg C, Molin S (2004) Транспозоны Mini-Tn7 для сайт-специфической маркировки бактерий флуоресцентными белками. Env Microbiol 6: 726–732.
44. 44. Бао Ю., Лиз Д.П., Фу Х., Робертс Г.П. (1991) Улучшенная система на основе Tn7 для вставки одной копии клонированных генов в хромосомы грамотрицательных бактерий.Ген 109: 167–168.
45. 45. Geng HF, Belas R (2010) Экспрессия биосинтеза троподитиетиновой кислоты контролируется новым аутоиндуктором. Журнал бактериологии 192: 4377–4387.
46. 46. Хансен П.Дж. (1989) Динофлагеллята красного прилива Alexandrium tamarense — Влияние на поведение и рост инфузорий тинтиннид. Морская экология-Прогресс. Серия 53: 105–116.
47. 47. Guillard RR, Ryther JH (1962) Исследования морских планктонных диатомовых водорослей.1. Cyclotella nana Hustedt и Detonula confervacea (Cleve) Gran. Канадский журнал микробиологии 8: 229– &.
48. 48. Gatesoupe FJ (2002) Обработка пробиотиками и формальдегидом науплий Artemia в качестве корма для личинок минтая, Pollachius pollachius . Aquacult 212: 347–360.
49. 49. Prol MJ, Bruhn JB, Pintado J, Gram L (2009) ПЦР-обнаружение в реальном времени и количественная оценка рыбьего пробиотика Phaeobacter , штамм 27-4 и патогенного рыбьего Vibrio в микроводорослях, коловратке, Artemia и первой кормовой палтусе ( Psetta maxima ) личинки.J? Appl Microbiol 106: 1292–1303.
50. 50. Карневали О., Зампони М.К., Сульпицио Р., Ролло А., Нарди М. и др. (2004) Введение пробиотического штамма для улучшения здоровья морского леща во время развития. Aquacult Int 12: 377–386.
51. 51. Planas M, Vazquez JA, Marques J, Perez-Lomba R, Gonzalez MP, et al. (2004) Увеличение роста коловраток ( Brachionus plicatilis ) с помощью наземных молочнокислых бактерий. Aquacult 240: 313–329.
52. 52.Marques A, Dinh T, Ioakeimidis C, Huys G, Swings J и др. (2005) Влияние бактерий на Artemia franciscana , культивируемую в различных гнотобиотических средах. Appl Environ Microbiol 71: 4307–4317.
53. 53. Marques A, Thanh TH, Sorgeloos P, Bossier P (2006) Использование микроводорослей и бактерий для усиления защиты гнотобиотика Artemia от различных патогенов. Aquacult 258: 116–126.
54. 54. Манро П.Д., Хендерсон Р.Дж., Барбур А., Бирбек Т.Х. (1999) Частичная дезактивация коловраток ультрафиолетовым излучением: влияние изменений бактериальной нагрузки и флоры коловраток на смертность в начале кормления личинками камбала.Aquacult 170: 229–244.
55. 55. Мангор-Йенсен А., Адофф Г.Р. (1987) Поовая активность только что вылупившихся личинок трески Gadus morhua L. Физиология и биохимия рыб. 3: 99–103.
56. 56. Picchietti S, Mazzini M, Taddei AR, Renna R, Fausto AM и др. (2007) Влияние введения пробиотических штаммов на GALT личинок морского леща морского леща: иммуногистохимические и ультраструктурные исследования. Иммунология рыб и моллюсков 22: 57–67.
57. 57.Dimitroglou A, Merrifield DL, Carnevali O, Picchietti S, Avella M и др. (2011) Манипуляции с микробами для улучшения здоровья и продуктивности рыб — Средиземноморская перспектива. Иммунология рыб и моллюсков 30: 1–16.
58. 58. Ролло А., Сульпицио Р., Нарди М., Сильви С., Орпианези С. и др. (2006) Живая микробная кормовая добавка в аквакультуре для улучшения стрессоустойчивости. Физиология и биохимия рыб 32: 167–177.
59. 59. Перес-Санчес Т., Бальказар Дж. Л., Меррифилд Д.Л., Карневали О., Джоаккини Дж. И др.(2011) Экспрессия иммунных генов у радужной форели ( Oncorhynchus mykiss ), индуцированная пробиотическими бактериями во время инфекции Lactococcus garvieae . Иммунология рыб и моллюсков 31: 196–201.
60. 60. Harzevili ARS, VanDuffel H, Defoort T, Dhert P, Sorgeloos P, et al. (1997) Влияние выбранного штамма бактерий Vibrio anguillarum TR 27 на скорость роста коловраток в различных условиях культивирования. Aquacult Int 5: 183–188.
61. 61. Porsby CH, Webber MA, Nielsen KF, Piddock LJV, Gram L (2011) Трудно выбрать устойчивость и толерантность к троподитиетовой кислоте, противомикробному препарату в аквакультуре. Противомикробные агенты и химиотерапия 55: 1332–1337.
62. 62. Seyedsayamdost MR, Case RJ, Kolter R, Clardy J (2011) Химия Джекилла-и-Хайда Phaeobacter gallaeciensis . Химия природы 3: 331–335.
63. 63. Рао Д., Уэбб Дж. С., Кьеллеберг С. (2005) Конкурентные взаимодействия в биопленках смешанного вида, содержащих морскую бактерию Pseudoalteromonas tunicata .Appl Environ Microbiol 71: 1729–1736.
64. 64. Рао Д., Уэбб Дж. С., Кьеллеберг С. (2006) Микробная колонизация и конкуренция на морских водорослях Ulva australis . Appl Environ Microbiol 72: 5547–5555.
65. 65. Рао Д., Уэбб Дж. С., Холмстром С., Случай R, Лоу А и др. (2007) Низкая плотность эпифитных бактерий из морских водорослей Ulva australis препятствует расселению организмов-обрастателей. Appl Environ Microbiol 73: 7844–7852.

Происхождение жизни до сих пор остается загадкой, потому что там не было никого, кто мог бы документировать историю происхождения жизни для нас.Однако некоторые возможные объяснения происхождения жизни давались эволюционистами в разное время. Какой из f

Вопрос:

Происхождение жизни до сих пор остается загадкой, потому что там не было никого, кто мог бы документировать историю происхождения жизни для нас. Однако некоторые возможные объяснения происхождения жизни давались эволюционистами в разное время. Что из следующего соответствует истории возникновения жизни на Земле?

А.Трудно точно определить происхождение жизни, но маленькие неживые существа могут быть синтезированы случайным образом за миллионы лет, а затем объединены в макромолекулы и, наконец, упакованы в протобионт, который, возможно, дал начало жизни.

B. Некоторые метеориты могли упасть на Землю и оставить простые молекулы, которые дали начало жизни на Земле.

C. Поскольку теперь мы знаем, что РНК может служить генетическим материалом и катализатором и способна к самовоспроизведению, РНК могла дать начало жизни.

Д.Жизнь могла начаться как химический суп из различных простых молекул (газов): аммиака, метана, водорода и водяного пара, которые были источником энергии молнии для реакции.

E. Все вышеперечисленное.

Происхождение жизни

Земля возникла 4,5 миллиарда лет назад, когда гравитационные силы притягивали облака пыли из космоса к планете. Земля не могла поддерживать жизнь в течение миллиарда лет, однако после длительной вулканической активности, похолодания и образования газов жизнь внезапно возникла из неживых компонентов.С тех пор жизнь на Земле превратилась в жизнь, существующую сейчас на Земле.

Ответ и пояснение: 1

Из представленных возможностей наиболее подходящей для истории происхождения жизни на Земле является A. Трудно точно определить …

См. Полный ответ ниже.