Всаа аминокислоты как принимать: BCAA: как правильно принимать аминокислоты, на что они влияют и где содержатся

BCAA – топливо для мышечной ткани

Важнейшим компонентом питания любого спортсмена является белок. Поступая в организм, он расщепляется до аминокислот, которые и влияют на рост мышечной ткани, на восстановление после тренировок, на качественный обмен веществ и оптимальную циркуляцию крови, а также препятствует потере мышечных волокон при соблюдении низкокалорийной диеты. А так как на расщепление белковой пищи тратится определенное количество энергии, важно, чтобы спортсмен употреблял в период повышенных нагрузок аминокислоты в чистом виде. И BCAA как нельзя лучше подходят для этого.

Ссылка на гидру без тора там

BCAA: что это такое и с чем его едят?

Если обратиться к энциклопедическим данным, то BCAA – это комплекс, который состоит из трех важных компонентов:

1. Изолейцин – аминокислота, участвующая в клеточном метаболизме, в синтезе гемоглобина, выполняет кроветворную функцию. Важна для регулирования уровня сахара в крови, для расщепления холестерина и вывода из организма бесполезных жиров. Данный компонент способствует росту мышечных волокон, повышению уровня силы и выносливости. В синтезированном виде присутствует в таких продуктах как печень, куриное мясо, рыба, соя.

2. Лейцин – аминокислота, которая отвечает за образование белков. Участвует компонент в процессах восстановления мышечных тканей и костной системы. Отвечает за энергетическую подпитку во время сложных тренировочных процессов. Кроме того, эта составляющая БЦАА нужна для выработки гормона счастья или серотонина, что особенно важно для формирования мотивации в подготовке к соревнованиям или для корректировки фигуры. Присутствует лейцин в следующих продуктах – соя, бобы, пшеничная мука, орехи, бурый рис.

3. Валин – это аминокислота, которую называют источником энергии. Он синтезируется в мышечные волокна, необходим для обмена веществ. Его потребление поможет снизить усталость, быстро восстановиться после длительной нагрузки. Сконцентрирована данная аминокислота в моркови и свекольном соке, в молочных и зерновых продуктах, арахисе.

Таким образом, каждая из перечисленных аминокислот важна для человека. И чтобы они поступали в должном количестве в организм, достаточно употреблять БЦАА – комплекс, название которого в дословном переводе с английского означает «аминокислоты с разветвленной боковой цепочкой» или «источник энергии». А, следовательно, функции данной спортивной добавки следующие:

• улучшает, ускоряет синтез белка;
• препятствует катаболизму, который приводит к разрушению мышечной ткани;
• восстанавливает мышечные волокна;
• препятствует так называемой «сушке» мышц в период отдыха или перерывов между тренировками;
• снижают надоедливую жировую прослойку;
• увеличивают отдачу от приема витаминно-минеральных комплексов.

Все перечисленные выше функции и характеристики аминокислот, подобранных в оптимальном соотношении в БЦАА делают его незаменимым для различных категорий людей, придерживающихся активной жизненной позиции. Они рекомендованы:

• спортсменам – атлетам, бодибилдерам, марафонцам;
• любителям фитнеса, аэробики и других дисциплин в физической подготовке, где важна и сила, и выносливость;
• желающим похудеть, нарастить массу тела за счет мышц и снизить жировую прослойку;
• людям, которые восстанавливаются после серьезных операций.

Таким образом, BCAA – это, в действительности, полезное спортивное питание, которое может быть лучшим способом восстановления после тренировок и «инструментом» для получения энергии перед серьезными соревнованиями и силовыми упражнениями.

Как принимать BCAA или оптимальное время потребления аминокислот?

Как же принимать добавку, чтобы она оказывала положительный эффект? На упаковке довольно часто производители детально расписывают дозировку и необходимую для восстановления норму потребления аминокислот. В среднем, рекомендуется в день тренировки принимать по 30 грамм выбранного комплекса. В некоторых случаях и в период отдыха (дни, когда отсутствуют занятия и мышцы восстанавливаются после нагрузки) эту дозировку не уменьшают.

Прием BCAA можно осуществлять по следующей схеме:

• после пробуждения необходимо растворить порошок в молоке или воде, принять для бодрости и энергичности;
• перед тренировкой для подготовки мышечной ткани к нагрузке и лучшему усвоению белка;
• во время тренировки подзарядка данным энергетическим комплексом будет положительно сказываться на выносливости спортсмена;
• перед ночным сном порция аминокислот будет оптимальным выбором в пользу восстановления мышц и всего организма в целом.

Данный план употребления в пищу аминокислотного комплекса считается примерным. Он корректируется в зависимости от тренировочного плана, предписанной диеты, а также от распорядка дня. Так, для снижения аппетита и замедления утреннего катаболизма БЦАА употребляют в перерывах между приемами пищи и до завтрака. Некоторые спортсмены дабы снизить чувство сытости и зарядиться энергией уже после занятий разводят порошок в воде с сахаром и тем самым пополняют запасы аминокислот уже после тренажерного зала.

Дозировка, как впрочем, и график приема аминокислотной добавки, также подбирается в индивидуальном порядке. Не стоит гнаться за рекомендуемой ежедневной дозой в 7-10 грамм, так как переизбыток или недостача в организме этих составляющих не даст желанного эффекта от приема BCAA.

Чем БЦАА лучше остальных аминокислот и можно ли его заменить?

Главной отличительной особенностью рассматриваемого комплекса аминокислот заключается в том, что он усваивается непосредственно в мышцах, не расщепляясь в печени и не растрачивая нужных компонентов на кровообращение. Следовательно, усвоение БЦАА происходит гораздо быстрее и «точечно», то есть там, где это необходимо – в мышечных волокнах.

Довольно часто изолейцин, лейцин и валин добавляют в различные протеиновые добавки и смеси. Они присутствуют в спортивном питании известных брендов. Кроме того, по отдельности и в различных количествах аминокислоты поступают в организм с продуктами питания. Но для того, чтобы от тренировок, от ежедневных занятий был положительный эффект важно принимать BCAA в чистом виде. При соблюдении инструктивного материала и рекомендаций, которые дают производители, данная добавка будет приносить только пользу. Мышцы станут расти и восстанавливаться быстрее, уйдет на второй план чувство усталости и тревоги, улучшится общее самочувствие. Результатом станет не только достижение определенных показателей в спорте, но и корректировка фигуры – лишних жировой прослоек не останется. Человек будет выглядеть бодрым, энергичным и подтянутым. А это важно и для бодибилдеров, и для тяжелоатлетов, и для тех, кто в спортзале пытается изменить свою внешность и стать еще краше!

Рекомендуемые BCAA:

Как принимать аминокислоты?

Аминокислоты могут быть в разных формах. В таблетках, порошке и в форме гелей.

У каждой формы своя особенность, которая и влияет на способ их применения.

Какая из форм аминокислот лучше, ответить сложно, так как в каждой есть свои плюсы и минусы. Советуем попробовать все и выбрать для себя наиболее удобную, подходящую под Ваш тип физических нагрузок.

Давайте разберем основные формы и познакомимся с особенностями их применения на примере продуктов aminoVITAL

Аминокислоты в таблетках

Здесь Ajinomoto может предложить aminoVITAL Tablets. Сразу можно отметить большой срок годности (24 месяца), а также компактную упаковку, которую можно брать с собой как на тренировку, так и во время путешествий.

Ajinomoto рекомендует принимать aminoVITAL Tablets 3 раза в день по 2 таблетки, до и после тренировки. Возможен дополнительный приём перед сном. 

Ajinomoto приготовил сразу 2 продукта в порошке: AminoVITAL PRO и AminoVITAL GOLD

Основным плюсом тут является легкость применения. Оба продукта расфасованы в небольшие порционные пакетики (саше), которые удобно брать с собой на тренировку.

Для употребления достаточно открыть пакетик и засыпать содержимое в рот (при необходимости запить небольшим количеством воды).

aminoVITAL Amino Pro рекомендуется принимать по 2 пакетика в день: 1 пакетик за 30 минут до тренировки или сразу после тренировки, 1 пакетик — в течение дня, но не позднее, чем за 30 минут до сна.

aminoVITAL Gold также рекомендуется принимать по 2 пакетика в день: 1 пакетик за 30 минут до тренировки или сразу после тренировки, 1 пакетик — в течение дня, но не позднее, чем за 30 минут до сна.

Одним из плюсов аминокислот в гелях является быстрая усвояемость продукта, что позволяет принимать продукт непосредственно перед, а также во время тренировки.

Здесь Ajinomoto предлагает 4 разных геля.

aminoVITAL® Multy Energy рекомендуется принимать содержимое 1-2 пакетов до тренировки и содержимое 1-2 пакетов сразу после окончания тренировки. (для улучшения вкусовых качеств следует охладить): Продолжительность приема не более 4 недель в зависимости от интенсивности нагрузок, массы тела, возраста и уровня подготовки.

aminoVITAL® Guts Gear рекомендуется принимать 1-2 раза в день (для улучшения вкусовых качеств следует охладить): 1 упаковку (250 г) выпить за 30 минут до тренировки, 1 упаковку — сразу после окончания тренировки или в течение дня.

aminoVITAL GOLD JELLY рекомендуется употреблять после тренировки, охлажденным, сразу после вскрытия упаковки (состав продукта не изменяется при низких температурах, однако возможны изменения в его структуре), по 1 — 2 упаковки в день.

aminoVITAL Perfect Energy рекомендуется употреблять до или во время интенсивных продолжительных тренировок, по 1 — 2 упаковки в день. Употреблять охлажденным, сразу после вскрытия упаковки (состав продукта не изменяется при низких температурах, однако возможны изменения в его структуре).

Обращаем Ваше внимание, что для наибольшей эффективности желательно проконсультироваться со специалистом по спортивно медицине. Также при приеме необходимо учитывать индивидуальную подготовленность, массу тела, интенсивность нагрузок и индивидуальную переносимость компонентов.

Спортивные добавки » Аминокислоты ВСАА

Каждый посетитель тренажерного зала со временем начинает задумываться о том, что бы ему такого купить и съесть, чтоб хотя бы чуть – чуть быстрее получить заветный результат. И для поиска ответа на свой вопрос он обращается за помощью к интернету, где куча мусороподобной информации или же прямиком идет в первый попавшийся магазин спортивного питания, в котором, конечно же, сидит продавец, который является «Богом» маркетинга и он способен продать неосведомленному новичку все самые «лучшие» нерабочие добавки. Чтобы помочь вам избежать этой участи я и решил написать для вас небольшую статейку, по поводу того, какую добавку я считаю действительно рабочей и необходимой для приема в независимости от ваших целей. Имя этой добавки – АМИНОКИСЛОТЫ ВСАА.

Для начала разберемся, что это такое эти ВСАА.

ВСАА (сокращение от английского названия – branched chain amino acids) – это три незаменимых аминокислоты (Лейцин, Изолейцин, Валин) с разветвленными боковыми цепочками. Исходя из того, что они являются НЕЗАМЕНИМЫМИ для нашего организма, а организм не способен самостоятельно их синтезировать, можно сделать вывод, что эти аминокислоты должны поступать извне, например, с пищей или из специальных добавок ВСАА. Научно доказано, что наши мышцы состоят из ВСАА на 35 %, а содержание этих аминокислот в белках из пищи ровняется не более 25 % от общего числа аминокислот содержащихся в белке того или иного продукта. Этот факт дает нам понять, что получать в достатке ВСАА не применяя спортивного питания вряд ли получиться.

Для чего применяются ВСАА?

В первую очередь эти аминокислоты необходимо принимать для того, чтобы ускорить восстановление мышечных волокон и организма в целом после тяжелых тренировок. Чем быстрее и лучше вы восстановитесь, тем большего результата вы сможете добиться, так как рост мышечной массы происходит не во время тренировки, а во время отдыха (восстановления).

Во вторых ВСАА обладают антикатаболическими свойствами (защищают от разрушения мышечную ткань), что делает актуальным их прием в период сушки. Принимая ВСАА в достаточном количестве во время избавления от подкожного жира, вы максимально сохраняете ваши мышцы.

ВСАА является очень универсальной добавкой, а самое главное, что эти аминокислоты действительно работают и это подтверждают множество научных исследований, которые можно спокойно найти в интернете (если конечно не лениться).

Как принимать ВСАА?

Обычно самым разумным временем приема этих аминокислоты является время, когда необходимо подавить катаболические процессы. Первый прием ВСАА я выношу на утро, сразу же, как просыпаюсь, так как после долгого сна организм истощен и нуждается в белке. Приняв утром ВСАА, я моментально подавляю катаболизм, так как скорость усвояемости этих аминокислот очень высокая, и они начинают работать сразу же после их приема.

Второй прием ВСАА у меня происходит, как правило, до тренировки. Делаю я это для того, чтобы уберечь свои мышцы от ненужного разрушения, кстати говоря, ВСАА еще называют «топливом» для мышц, так что пусть лучше горят ВСАА из баночки, чем мои родимые мышцы.

Третий прием ВСАА это сразу после тренировки, так как именно в это время требуется быстрый белок, чтобы подавить катаболические процессы и запустить процессы восстановления.

Ну и чтобы обогатить свой рацион БЦАшками (такое ласковое название у них в качковском братстве), я принимаю 1-2 порции в течение дня. Особенно люблю добавить их в творог, так как покупаю порошковые ВСАА с фруктовым вкусом, и получается очень даже неплохой творожок.

Формы ВСАА.

Здесь на самом деле нет ничего сложного. Существуют несколько форм этих аминокислот:

— Жидкая форма: Продаются в бутылках с надписью Liquid. Не пробовал, ничего по ним сказать не могу, знаю только, что отзывы о них хорошие)))  

Основная разница между ними это скорость усвояемости и, конечно же, цена. Порошковые и жидкие формы являются более быстрыми формами, чем таблетированные и капсульные.

Лично я предпочитаю порошковые формы, так как они не дорогие, быстро усваиваются и некоторые, благодаря добавлению подсластителей и прочих штук, имеют очень приятный вкус.

Самым идеальным соотношением этих аминокислот на порцию считается 2:1:1 (2 грамма лейцина; 1 грамм изолейцина; 1 грамм валина).

Ну что, друзья, я думаю, этой информации вам будет достаточно, чтобы сделать вывод по поводу целесообразности приема аминокислот ВСАА. Ну а я, как всегда желаю вам успехов, и достигайте всех поставленных целей!           

Принимать аминокислоты или BCAA? Лучше — совместить! » Спортивные новости и аналитика

У профессиональных спортсменов и бодибилдеров не вызывает сомнений необходимость использования качественного спортивного питания. Оно необходимо для восстановления мышц и организма в целом, роста как результатов в зале, так и мышечной массы. Новички часто не знают, что принимать, как и для чего. Если о протеине, как источнике белка, осведомлены почти все, то с ВСАА и аминокислотами много пробелов в знаниях.

Приобрести эти добавки по выгодным ценам вы можете на сайте extremepower. com.ua/aminokicloti. Это высококлассная продукция от украинского производителя, купить которую можно на развес с доставкой по всей территории нашей страны. Но и предварительно решить, зачем этот спортпит нужен и как он работает, все же не помешает.

Немного теории

Аминокислоты в организме человека принимают непосредственное участие в синтезе белка. Он же нужен для эффективной работы мышц и их роста. Восполнить потребность в аминокислотах можно тремя способами:

• приемом протеина;
• приемом отдельных аминокислот;
• приемом аминокислотного комплекса.

О двух последних вариантах стоит поговорить подробнее.

Что дают аминокислотные комплексы?

Эти микроэлементы не позволяют мышечным волокнам разрушаться. В результате восстановление мышц происходит быстрее, как и рост их массы. Эффект наступает достаточно быстро, так как не нужно ждать расщепления употребленного белка, в организм попадают готовые к усвоению аминокислоты.

Аминокислотные комплексы включают большой набор аминокислот — до 28, в том числе и все компоненты BCAA. По эффективности они равны протеину, давая организму все необходимое для прироста сухой мышечной массы. Вот собственно для этого их и принимают спортсмены.

Что дает BCAA?

ВСАА — это комплекс, в которых входят лишь три важнейшие аминокислоты, а именно изолейцин, валин и лейцин. Эти микроэлементы непосредственно участвуют в восстановительных процессах мышечных тканей, не позволяя им разрушаться, что также важно для бодибилдеров.

Если вам нужно BCAA, то заходите на сайт extremepower.com.ua/bcaa и оформляйте заказ с доставкой по Украине.

Выводы

Таким образом, описанные выше спортивные добавки не исключают друг друга, а наоборот, дополняют. Одни помогают восстанавливаться («бецеашки»), а другие расти (кислоты), так что их целесообразно принимать вместе. Отказаться от аминокислот можно лишь при приеме протеина, то есть вполне достаточно употреблять его вместе с BCAA.

Также отличается и сам прием. Так как активный рост мышц происходит во время восстановления, аминокислоты лучше принимать вечером (перед сном) или сразу после пробуждения. А вот bcaa эффективен непосредственно до или после тренировок, в ходе которых и происходит разрушение волокон.

BCAA применение, дозировки и противопоказания.

 ​BCAA – branched chain amino acids – это незаменимые аминокислоты с разветвленной цепью. Относятся к самым эффективным и полезным комплексом аминокислот.

BCAA состоит из:

    Лейцина;

    Валина;

    Изолейцина.

Этот аминокислотный комплекс является основой для построения мышечной массы, также он помогает восстановиться после тренировки, обладает атикатаболическими действиями и способствуют повышению анаболизма. Главным отличием BCAA от семнадцати других аминокислот заключается в том, что они в первую очередь начинают метаболизироваться в мышцах, что способствует увеличению силовых показателей.

Поскольку комплекс BCAA считается незаменимым, т.е. организм не может сам воспроизвести эти аминокислоты, они должны поступать в организм вместе и пищей или в виде специальной добавки.

Среднее содержание аминокислот BCAA в белках составляет 20-25%.  Однако большая из часть разрушается в процессе пищеварения. Именно поэтому стоит принимать BCAA в виде дополнительной добавки, особенно это актуально для бодибилдеров.

Когда нужно принимать BCAA?

Комплекс BCAA лучше всего употреблять до и после тренировки. В этот период наилучшее усвоение этих аминокислот. Также BCAA можно принимать с утра, для подавления катаболизма после сна.

Исследования показали, что если смешать протеиновый коктейль с BCAA, то их эффективность не снизится. Впрочем их можно принимать абсолютно с любым спортивным питанием. Лучше всего BCAA сочетаются с гейнером, протеином, креатином.

Кроме всего этого BCAA можно принимать во время похудения, лучше всего его употреблять в промежутках между приемами пищи, чтобы снизить катаболизм и аппетит.

Сколько нужно принимать BCAA?

 Как для набора мышечной массы, так и для похудения оптимальной дозой BCAA считает от 4 до 8 грамм, принимать незаменимые аминокислоты нужно до 3 раз в сутки. Прием BCAA не требует ограничений, его можно принимать без циклирования.

Побочные действия и противопоказания

Принимая во внимание то, что аминокислоты BCAA получают из белковых продуктов, то можно с уверенностью сказать, что BCAA это совершенно натуральный продукт. Однако при приеме достаточно больших доз (в нашей 10-и летней практике такого не было ни разу) может возникнуть аллергия, которая проявится в виде:

    Сыпи;

    Озноба;

    Возможно расстройство пищеварения.

При оптимальной дозировки BCAA побочных действий не обнаружено.

Структурная основа связывания флуоресцентных сайт-специфичных дансилированных аминокислот с сывороточным альбумином человека

Принадлежности Расширять

Принадлежность

• ¹ Секция биофизики, лаборатория Блэкетта, Имперский колледж, Эксибишн-роуд, Лондон SW7 2AZ, Соединенное Королевство.

Элемент в буфере обмена

Али Дж. Райан и др. J. Struct Biol. 2011 апр.

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Принадлежность

• ¹ Секция биофизики, лаборатория Блэкетта, Имперский колледж, Эксибишн-роуд, Лондон SW7 2AZ, Соединенное Королевство.

Элемент в буфере обмена

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Абстрактный

Сывороточный альбумин человека (HSA) имеет два основных сайта связывания для молекул лекарства.Эти сайты выборочно связываются с различными дансилированными аминокислотными соединениями, которые из-за их собственной флуоресценции долгое время использовались в качестве специфических маркеров для карманов лекарств на HSA. Мы представляем здесь сокристаллические структуры HSA в комплексе с шестью дансилированными аминокислотами, которые специфичны либо для лекарственного сайта 1 (дансил-1-аспарагин, дансил-1-аргинин, дансил-1-глутамат), либо для лекарственного сайта 2 (дансил-1-глутамат). -л-норвалин, дансил-1-фенилаланин, дансил-1-саркозин). Наши результаты объясняют структурную основу сайт-специфичности различных дансилированных аминокислот.Они также показывают, что связывание жирных кислот имеет лишь умеренный эффект на связывание дансилированных аминокислот с сайтом 1 лекарственного средства и идентифицируют местоположение вторичных сайтов связывания.

© 2010 Elsevier Inc. Все права защищены.

Цифры

Расположение сайтов связывания дансилированных…

Расположение сайтов связывания дансилированных аминокислот определено с помощью рентгеновской кристаллографии. (а) Моделирование…

Расположение сайтов связывания дансилированных аминокислот определено с помощью рентгеновской кристаллографии.(a) Имитация отжига F _o — F _c пропускная карта (контур 3 σ ), показывающая, что DanF связан с сайтом 2 лекарственного средства в субдомене IIIA. DanF показан в виде стержня с атомами, раскрашенными по типу атома: C — фиолетовый; О — красный; и N — синий. Поддомен IIIA показан в виде ленты (синий). Выбранные боковые цепи белка показаны в виде полосок с серыми атомами углерода. (b) Обзор DanN, связанного с сайтами 1 и 2 препарата в HSA. Лиганды показаны в виде карандаша с полупрозрачной молекулярной поверхностью.Вторичная структура белка показана окрашенной субдоменом. Эта цветовая гамма сохраняется повсюду. (c) Обзор DanN, связанного с субдоменами IIA и IB в HSA-миристате. Семь сайтов связывания жирных кислот в белке обозначены как FA1-FA7. (Для интерпретации ссылок на цвет в легенде этого рисунка читателю отсылается к веб-версии этой статьи.)

Связывающие взаимодействия дансилированного амино…

Связывающие взаимодействия, осуществляемые дансилированными аминокислотами (DanN, DanE, DanR) в лекарственном сайте 1…

Связывающие взаимодействия, осуществляемые дансилированными аминокислотами (DanN, DanE, DanR) в лекарственном сайте 1 (субдомен IIA) HSA в отсутствие и в присутствии жирной кислоты. (а) Связывание DanN (окрашено типом атома, как на рис. 1b). Водородные связи показаны пунктирными голубыми линиями. (b) Сравнение связывания DanN и варфарина (Petitpas et al., 2001). Вид немного повернут влево по сравнению с панелью a; полипептид, содержащий Y150, был удален для ясности. (c) Связывание DanN с HSA в присутствии миристата (показано в виде сфер CPK, окрашенных в зависимости от типа атома: углерод — серый и кислород — красный). (d) Сравнение связывания DanN, DanE и DanR с HSA-миристатом.(Для интерпретации ссылок на цвет в легенде этого рисунка читателю отсылается к веб-версии этой статьи.)

Связывающие взаимодействия дансилированного амино…

Связывающие взаимодействия дансилированных аминокислот (DanSRC, DanNV, DanF и DanN) в лекарстве…

Рис. 3

Связывающие взаимодействия, осуществляемые дансилированными аминокислотами (DanSRC, DanNV, DanF и DanN) в лекарственном сайте 2 (субдомен IIIA) HSA. (а) Связывание DanF (окрашено типом атома, как на рис. 1а). Водородные связи показаны пунктирными голубыми линиями. (b) Сравнение связывания DanF и индоксилсульфата (IDS) Ghuman et al., 2005; атомы углерода в IDS окрашены в темно-желтый цвет. (c) Сравнение связывания DanF, DanNV и DanSRC с лекарственным сайтом 2 HSA. (d) Сравнение связывания DanF и DanN с лекарственным сайтом 2 HSA. (Для интерпретации ссылок на цвет в легенде этого рисунка читателю отсылается к веб-версии этой статьи.)

Похожие статьи

• Длинноцепочечные жирные кислоты изменяют интерактивное связывание лигандов с двумя основными сайтами связывания лекарств сывороточного альбумина человека.

  Ямасаки К., Хёдо С., Тагучи К., Ниси К., Ямаоцу Н., Хироно С., Чуанг В.Т.Г., Со Х., Маруяма Т., Отагири М. Ямасаки К. и др. PLoS One. 29 июня 2017 г .; 12 (6): e0180404. DOI: 10.1371 / journal.pone.0180404. Электронная коллекция 2017. PLoS One. 2017 г. PMID: 28662200 Бесплатная статья PMC.

• Связывание с альбумином при уремии: количественная оценка ингибирования эндогенными лигандами и карбамилирования альбумина.

  Денглер Т.Дж., Робертц-Ваупель ГМ, Денглер Х.Дж. Dengler TJ, et al. Eur J Clin Pharmacol. 1992; 43 (5): 491-9. DOI: 10.1007 / BF02285090. Eur J Clin Pharmacol. 1992 г. PMID: 1282889

• Связывание моноацилглицерина с сывороточным альбумином человека: доказательство того, что моноолеоилглицерин связывается в дансилсаркозиновом участке.

  Тумсер А.Е., Бакленд АГ, Уилтон, округ Колумбия.Thumser AE, et al. J Lipid Res. 1998 Май; 39 (5): 1033-8. J Lipid Res. 1998 г. PMID: 9610770

• Сайты связывания флуоресцентных зондов сывороточного альбумина человека.

  Мюллер Н., Лапик Ф., Дрелон Э., Неттер П. Muller N, et al. J Pharm Pharmacol. 1994 Апрель; 46 (4): 300-4. DOI: 10.1111 / j.2042-7158.1994.tb03798.x. J Pharm Pharmacol. 1994 г. PMID: 7519671

• Влияние свободных жирных кислот на кинетику связывания на сайте связывания бензодиазепина гликированного сывороточного альбумина человека.

  Кейта Ю., Крацер В., Вернер В., Ритброк Н. Кейта Ю. и др. Int J Clin Pharmacol Ther Toxicol. 1993 июл; 31 (7): 337-42. Int J Clin Pharmacol Ther Toxicol. 1993 г. PMID: 76

Процитировано

• Влияние окислительного стресса на структуру сывороточного альбумина как носителя выбранного диазафенотиазина с потенциальной противоопухолевой активностью.

  Maciek-Jurczyk M, Morak-Młodawska B, Jeleń M, Kopeć W, Szkudlarek A, Owczarzy A, Kulig K, Rogó W., Pożycka J. Maciek-Jurczyk M, et al. Фармацевтические препараты (Базель). 2021 23 марта; 14 (3): 285. DOI: 10.3390 / ph24030285. Фармацевтические препараты (Базель). 2021 г. PMID: 33806875 Бесплатная статья PMC.

• Разрешение событий связывания на многофункциональном сывороточном альбумине человека.

  Венсковский Л., Вагнер М., Ройш Дж., Шройдер Х., Материя Н, Опатц Т., Петри С.М. Wenskowsky L, et al. ChemMedChem. 2020 6 мая; 15 (9): 738-743. DOI: 10.1002 / cmdc.202000069. Epub 2020 19 марта. ChemMedChem. 2020. PMID: 32162429 Бесплатная статья PMC.

• Агрегация / фибрилляция альбумина сыворотки человека и ее способность связывать лекарственные средства.

  Maciek-Jurczyk M, Janas K, Pożycka J, Szkudlarek A, Rogó W., Owczarzy A., Kulig K.Maciek-Jurczyk M, et al. Молекулы. 2020 31 января; 25 (3): 618. DOI: 10,3390 / молекулы25030618. Молекулы. 2020. PMID: 32023900 Бесплатная статья PMC.

• Связывание руксолитиниба с сывороточным альбумином человека: биоинформатика, биохимическая и функциональная характеристика на клеточных моделях JAK2V617F ⁺ .

  Де Маринис Э., Чеккерелли А., Кватрокки А., Лебоффе Л., Полтичелли Ф., Нерви С., Асченци П.Де Маринис Э. и др. Научный доклад 8 ноября 2019 г .; 9 (1): 16379. DOI: 10.1038 / s41598-019-52852-9. Научный представитель 2019. PMID: 31704999 Бесплатная статья PMC.

• Механизмы специфического и неспецифического взаимодействия ингибиторов и аттенюаторов, склонных к агрегации.

  Боултон С., Селваратнам Р., Ахмед Р., Ван К., Ченг Х, Мелачини Дж. Boulton S, et al. J Med Chem. 2019 23 мая; 62 (10): 5063-5079.DOI: 10.1021 / acs.jmedchem.9b00258. Epub 2019 10 мая. J Med Chem. 2019. PMID: 31074269 Бесплатная статья PMC.

использованная литература

1. 1. Антолини Л., Менабуэ Л., Сола М., Батталья Л.П., Корради А. Влияние дансильной группы на координационную способность N-защищенных аминокислот. Часть 2.Бинарные комплексы меди (II) и их аддукты пиридина и 2, 2′-бипиридина. Кристаллическая и молекулярная структура комплексов аквабис (N-дансилглицинато-0) бис (пиридин) меди (11) и (2, 2′-бипиридин) — (N-дансилглицинато-NO) (метанол) меди (II) и нейтральной N-дансилглицин. J. Chem. Soc. Dalton Trans. 1986: 1367–1373.
2. 1. Бхаттачарья А.А., Карри С., Фрэнкс Н.П. Связывание общих анестетиков пропофола и галотана с сывороточным альбумином человека: кристаллические структуры с высоким разрешением.J. Biol. Chem. 2000; 275: 38731–38738. — PubMed
3. 1. Бхаттачарья А.А., Грюне Т., Карри С. Кристаллографический анализ показывает общие способы связывания жирных кислот со средней и длинной цепью с сывороточным альбумином человека. J. Mol. Биол. 2000; 303: 721–732.- PubMed
4. 1. Биркетт Д.Дж., Майерс С.П., Садлоу Г. Влияние жирных кислот на два конкретных сайта связывания лекарств на сывороточный альбумин человека. Мол. Pharmacol. 1977; 13: 987–992. — PubMed
5. 1. Бродерсен Р.Связывание билирубина с альбумином. CRC Crit. Преподобный Clin. Лаборатория. Sci. 1980; 11: 305–399. — PubMed

Показать все 42 ссылки

Условия MeSH

• Аргинин / аналоги и производные
• Аспарагин / аналоги и производные
• Соединения дансила / метаболизм *
• Фенилаланин / метаболизм
• Саркозин / аналоги и производные
• Альбумин сыворотки / метаболизм *

LinkOut — дополнительные ресурсы

• Источники полных текстов

• Другие источники литературы

цитировать

Формат: AMA APA ГНД NLM

Неповрежденный С-конец альбумина необходим для его длительного периода полужизни в организме человека

Создание и производство вариантов HSA

A pcDNA3.1 вектор, содержащий кДНК, кодирующую полноразмерный HSA, был описан ранее ²⁰ , и фрагменты кДНК, кодирующие модифицированную последовательность DIII (K573P, L585X, Bazzano; (567) ALPRRVKNLLLQVKLP (582), Катания; (580) KLP (582) , Rugby Park; (572) LLQFSSF (578) и Venezia; (572) PTMRIRE (578)) были субклонированы в вектор с использованием сайтов рестрикции BamHI и Xhol (GenScript, NJ, США). Варианты HSA получали путем временной трансфекции прикрепленных клеток HEK293E (ATCC) с использованием полиэтиленимина Max (Polysciences).Для сравнения уровней экспрессии HSA дикого типа и генетических вариантов клетки HEK293E высевали в шестилуночные планшеты и выращивали до 95–100% конфлюэнтности перед трансфекцией. Среду для выращивания собирали и заменяли на 1, 2, 4 и 6 дни после трансфекции, и уровни секретируемого белка определяли количественно с использованием двустороннего ELISA против HSA, описанного ниже. Для производства большего количества белка клетки HEK293E выращивали в колбах T175 и трансфицировали при 95–100% конфлюэнтности. Среду для выращивания собирали и заменяли каждый второй день в течение до 2 недель после трансфекции, прежде чем варианты HSA были очищены из собранных сред с использованием аффинной матрицы CaptureSelect (технологии Life), упакованной в колонку объемом 5 мл (Atoll).Колонку предварительно уравновешивали 1 × PBS / 0,05% азидом натрия перед нанесением супернатанта со скоростью потока 1-2 мл / мин. Колонку промывали 100 мл 1 × PBS / 0,05% азида натрия перед тем, как связанный белок элюировали 50 мл 0,1 M глицин-HCl (pH 3,0) и нейтрализовали 1 M трис-HCl (pH 8,0). Собранный белок концентрировали и заменяли буфер на 1 × PBS с использованием колонок Amicon Ultra-15 30 K (Millipore). Эксклюзионную хроматографию выполняли с использованием колонки Superdex 200, увеличение 10/300 GL (GE Healthcare).Мономерную фракцию собирали и концентрировали с использованием колонок Amicon Ultra-0.5 30 K (Millipore). Концентрации белка определяли с помощью спектрофотометра DS-11 (DeNovix). Каждый вариант HSA (2 мкг) смешивали с буфером для образцов LDS (Novex) и дистиллировали H ₂ О. Образцы загружали в 12% -ный бис-трис-гель NuPAGE SDS-PAGE параллельно с Spectra ^TM Multicolor Wide Range. Protein Ladder (Thermo Fisher) и разделяли при 200 В в течение 22 минут в буфере MES с последующим окрашиванием кумасси бриллиантовым синим (Bio-Rad).

Производство рекомбинантного hFcRn

Вектор, содержащий кДНК, кодирующую три эктодомена (α1 – α3) hFcRn HC, генетически слитые с глутатионом Schistosoma japonicum S -трансферазой (GST) и β _{человека 2 использовалась субъединица} мкм ⁶⁴ . Растворимый меченный GST hFcRn экспрессировали временно трансфицированными клетками HEK293E, как описано выше, и очищали с использованием колонки GSTrap FF (GE Healthcare). Вкратце, колонку предварительно уравновешивали 1 × PBS / 0.05% азид натрия перед нанесением надосадочной жидкости со скоростью 1-2 мл / мин. Колонку промывали 100 мл 1 × PBS / 0,05% азида натрия перед тем, как связанный рецептор элюировали 50 мл 10 мМ восстановленного глутатиона (Sigma-Aldrich), разведенного в 50 мМ трис-HCl (pH 8,0). Собранный рецептор концентрировали и заменяли буфер на 1 × PBS с использованием колонок Amicon Ultra-15 10 K (Millipore).

Для получения растворимого меченного His hFcRn использовали систему вектора экспрессии бакуловируса, как описано ранее ⁶⁵ .Вирусный запас, кодирующий меченный His hFcRn, был любезным подарком от доктора Салли Уорд (Техасский университет, Юго-западный медицинский центр, Даллас, Техас). Вкратце, вектор содержит кДНК, которая кодирует три эктодомена (α1 – α3) HC hFcRn, за которыми следуют шесть гистидинов, и субъединицу β ₂ m человека. Клетки High Five (Thermo Fisher Scientific) культивировали в среде Express FIVE SFM с добавлением 10 мМ L-глутамина и 1% антибиотика-антимиотика (Thermo Fisher Scientific). Клетки культивировали в суспензии при плотности 1 × 10 ⁶ клеток / мл при 27 ° C со встряхиванием при 160 об / мин, и в день заражения добавляли 1 мл исходного вирусного раствора на 500 мл культуры клеток. .После инфицирования клетки инкубировали при 23,5 ° C со встряхиванием при 160 об / мин в течение 72 часов с последующим центрифугированием при 3500 об / мин и 4 ° C в течение 40 минут. Супернатант фильтровали через фильтр 0,2 мкм (Millipore), и перед хранением при 4 ° C добавляли 0,05% азид натрия. Меченный His hFcRn очищали с использованием колонки HisTrap HP (GE Healthcare), снабженной ионами Ni ²⁺ , как описано ранее ²⁹ . Вкратце, супернатант доводили до pH 7,2, добавляя 1 × PBS / 0,05% азида натрия (pH 10.9). Колонку предварительно уравновешивали 1 × PBS / 0,05% азидом натрия перед нанесением надосадочной жидкости со скоростью 5 мл / мин. Колонку промывали 150 мл 1 × PBS / 0,05% азида натрия и 50 мл 25 мМ имидазола / 1 × PBS (pH 7,3) перед тем, как связанный рецептор элюировали 50 мл 250 мМ имидазола / 1 × PBS (pH 7,4). Собранный рецептор концентрировали и заменяли буфер на 1 × PBS с использованием колонок Amicon Ultra-15 10 K (Millipore). Эксклюзионную хроматографию выполняли с использованием колонки HiLoad 26/600 Superdex 200 (GE Healthcare), соединенной с прибором ÄKTA FPLC (GE Healthcare).Мономерную фракцию собирали и концентрировали с использованием колонок Amicon Ultra-15 10 K (Milipore).

Спектроскопия КД

Спектры КД регистрировали с использованием спектрополяриметра Jasco J-810 (Jasco International). Измерения проводили на WT HSA и L585X (150 мкг / мл) в 10 мМ PBS (pH 5,5) без NaCl при 20 ° C с использованием кварцевой кюветы (Starna) с длиной пути 0,1 см. Каждый образец сканировали пять раз при 20 нм / мин (ширина полосы 1 нм, время отклика 1 с) с диапазоном длин волн 190–260 нм.Данные усредняли и вычитали спектр контроля без образца.

связывание hFcRn-HSA ELISA

Мутант человеческого IgG1 (M252Y / S254T / T256E / h533K / N434F) со специфичностью в отношении 4-гидрокси-3-йод-5-нитрофенилуксусной кислоты ⁶⁶ (8 мкг / мл), разбавленный PBS (pH 7,4) добавляли в 96-луночные планшеты (Costar) и инкубировали в течение ночи при 4 ° C. Лунки блокировали PBS, содержащим 4% обезжиренного молока (PBSM) (pH 7,4), в течение 1 ч при комнатной температуре (RT), а затем трижды промывали PBS, содержащим 0.005% Твин 20 (PBST) (pH 5,5). His-меченный hFcRn (10 мкг / мл), разведенный в PBSTM (pH 5,5), добавляли в лунки и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Варианты HSA (15 мкг / мл или двукратные серийные разведения, начиная с 10 мкг / мл), разведенные в PBSTM (pH 5,5), добавляли в лунки в дубликатах и ​​инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Конъюгированные с пероксидазой хрена моноклональные мышиные антитела против HSA (1: 5000) (Abcam) или поликлональные козьи антитела против HSA, конъюгированные с щелочной фосфатазой (1: 3000) (Bethyl Laboratories, Inc.), разведенные в PBSTM (pH 5.5) добавляли в лунки и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Лунки промывали трижды PBST (pH 5,5) после инкубации каждого слоя. Лунки проявляли тетраметилбензидиновым субстратом (Calbiochem) или п-нитропенилфосфатным субстратом (10 мкг / мл) (Sigma-Aldrich), разведенным в диэтаноламиновом буфере. Поглощение измеряли при 620 нм или 405 нм с использованием спектрофотометра Sunrise (TECAN).

SPR

SPR выполняли с использованием Biacore 3000 или T200 (GE Healthcare). В соответствии с описанием, предоставленным производителем, сенсорные чипы CM5 были соединены с GST-меченным hFcRn (~ 2000 RU) или вариантами HSA (~ 200-500 RU) с использованием химии аминового связывания.Вкратце, связывание осуществляли путем инъекции рецептора (10 мкг / мл) или HSA (6–10 мкг / мл) в 10 мМ ацетате натрия, pH 4,5 (GE Healthcare). Для аффинных и кинетических измерений, двукратные серийные разведения мономерного His-меченного hFcRn (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 и 80 мкМ или 0, 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 16 и 32 мкМ) готовили в двух экземплярах и вводили поверх иммобилизованного HSA со скоростью 10 или 40 мкл / мин при 25 ° C. Относительное связывание полученного из сыворотки HSA (WT HSA и L585X) измеряли путем инъекции равных количеств (1 мкМ) иммобилизованного hFcRn при скорости потока 50 мкл / мин и температуре 25 ° C.Фосфатный буфер (67 мМ фосфатный буфер, 0,15 М NaCl, 0,05% Твин 20) при pH 5,5 или pH 7,4 использовали в качестве рабочего и разбавляющего буфера, тогда как буфер HBS-P (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 0,005% поверхностно-активное вещество P20). при pH 7,4 использовали для регенерации проточных ячеек. Все кривые связывания были отрегулированы на ноль, и значение контрольной клетки вычли. Кинетику связывания и значения сродства оценивали с использованием модели связывания лиганда Ленгмюра 1: 1 или модели равновесного (Req) связывания, предоставленной BIAevaluation 4.1 или оценочное программное обеспечение Biacore T200, версия 3.0.

HDX-MS

Все реагенты были приобретены у Sigma-Aldrich аналитической чистоты, за исключением гранул с иммобилизованным пепсином (Thermo Scientific). Реакцию обмена инициировали разбавлением вариантов HSA (20 пмоль) 1: 9 99% D ₂ O (111,2 мМ Na ₂ HPO ₄ , 44 мМ лимонной кислоты, pD _{читается как} = 5,530) при 25 ° С. ° C. Через 15 с, 1 мин, 10 мин, 60 мин, 480 мин и 2960 мин реакцию обмена гасили добавлением ледяного буфера гашения (0.8 M TCEP в 2 M глицине, pH = 2,305) в соотношении 1: 1, тем самым снижая pH _{, читаемое с} до 2,422. Закаленные образцы немедленно замораживали до 80 ° C до анализа. «Максимально меченые» контрольные образцы были приготовлены путем инкубации образцов в течение 2 дней при 25 ° C в присутствии дейтерированного гидрохлорида гуанидина (6 M), после чего образцы были обработаны, как описано выше. Все временные точки и образцы с «максимальной меткой» были выполнены в трех экземплярах, за исключением образца 2960 минут, который был проанализирован только один раз.

Включение дейтерия исследовали, как описано ранее ⁶⁷ . Образцы гашеного белка размораживали и загружали в охлаждаемую систему UPLC-HDX с обращенной фазой (Waters Inc.), охлажденную до 0 ° C. Система UPLC-HDX была оборудована колонкой с самоупаковкой пепсина с внутренним объемом 60 мкл, которая сохранялась снаружи, чтобы обеспечить быстрое онлайн-переваривание образцов дейтерированного белка при 20 ° C. Образованные пептиды улавливали на колонке-ловушке C18 (ACQUITY UPLC BEH C18 1.Колонка VanGuard, 7 мкм, Waters Inc.) и обессоливали в течение 3 мин при 200 мкл / мин 0,23% муравьиной кислоты в воде. После обессоливания путь потока системы был настроен так, чтобы позволить пептидам элюироваться на аналитической колонке C18 (ACQUITY UPLC BEH C18 1,7 мкм, колонка 1 × 100 мм, Waters Inc.). Здесь пептиды разделяли с помощью обращенно-фазовой хроматографии с коротким градиентом (7 мин) (растворитель A, 0,23% муравьиной кислоты в воде; растворитель B, 0,23% муравьиной кислоты в ацетонитриле) и ионизировали (в газовую фазу) положительным ионизация электрораспылением в гибридный масс-спектрометр Q-TOF (Synapt G2-Si, Waters Inc.). Перед масс-анализом пептидные ионы разделяли по их ионной подвижности. Идентификацию пептидов проводили на недейтерированных и полностью восстановленных образцах тандемной масс-спектрометрией с использованием как зависимых от данных, так и независимых от данных (MSe) методов сбора данных.

Коррекция заблокированной массы с помощью Glu ¹ -фибринопептид B был применен ко всем записанным спектрам. Чтобы выполнить идентификацию пептидов, данные были проанализированы в PLGS 3.0, который коррелирует ионы предшественников и фрагментов с локальной базой данных, содержащей последовательность WT HSA, пепсина, а также рандомизированные последовательности этих двух белков.Для определения поглощения дейтерия каждым пептидом данные HDX-MS анализировали с использованием программного обеспечения DynamX 3.0 (Waters Inc.). Чтобы предоставить доступ к данным HDX этого исследования, сводная таблица данных HDX (дополнительная таблица 2) и таблица данных HDX (дополнительные данные 1) включены во вспомогательную информацию в соответствии с рекомендациями сообщества ⁶⁸ .

HERA

Всего 7,5 × 10 ⁵ клеток HMEC1, стабильно экспрессирующих HA-hFcRn-EGFP ⁶⁹ , высевали в 24-луночные планшеты на лунку (Costar) и культивировали в течение 1 дня в среде для выращивания.Клетки дважды промывали и голодали в течение 1 часа в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS) (Life Technologies). WT HSA или L585X (1000 нМ), разведенные в 250 мкл HBSS (pH 7,4), добавляли на лунку и инкубировали в течение 4 часов. Среду удаляли, и клетки промывали пять раз ледяной HBSS (pH 7,4). Добавляли питательную среду с добавлением заменимых аминокислот MEM (Thermo Fisher) и собирали через 4 часа. Для количественного определения количества HSA в образцах использовали двусторонний ELISA против HSA, как описано ниже.

Исследования на мышах

В исследовании использовались две линии трансгенных мышей hFcRn: мыши Hemizygous Tg32 (B6.Cg-Fcgrt ^tm1Dcr Tg (FCGRT) 32Dcr / DcrJ; The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) Tg32-Alb ^{— / —} мышей с дефицитом альбумина (B6.Cg- Alb ^em12Mvw Fcgrt ^tm1Dcr Tg (FCGRT) 32Dcr / Mvw; Лаборатория Джексона). Мыши Tg32-Alb ^{— / —} (самцы, 11-16 недель, 20-25 г, четыре мыши в группе) получали WT HSA или L585X (4 мг / кг) в 20 мл / кг 1 × PBS путем внутрибрюшинной инъекции, и кровь (25 мкл) брали из ретроорбитального синуса через 1, 8, 14, 20, 30, 45 и 58 дней после инъекции.Мыши Tg32 (самцы, 7-8 недель, 20-25 г, пять мышей в группе) получали WT HSA или L585X (2 мг / кг) в 10 мл / кг 1 × PBS путем внутривенной инъекции, и кровь (25 мкл) взяты из ретроорбитального синуса через 1, 2, 3, 5, 7 и 10 дней после инъекции. Образцы крови смешивали с 1 мкл 1% K3-EDTA и выдерживали на льду до центрифугирования при 17000 × g в течение 5 минут при 4 ° C. Плазму выделяли и разбавляли 1:10 в растворе 50% глицерина / PBS и хранили при -20 ° C. Исследования на животных проводились в лаборатории Джексона (исследование Tg32, проведенное JAX Service, Бар-Харбор, штат Мэн) в соответствии с руководящими принципами и правилами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и их использованию в лаборатории Джексона.Для количественного определения количества HSA в плазме (разведенной 1: 200-1: 400 в PBSTM) использовали двусторонний ELISA против HSA, как описано ниже. Концентрация в плазме была представлена ​​как процент, оставшийся в кровотоке в различные моменты времени после инъекции, по сравнению с концентрацией в день 1 (100%). Период полураспада β-фазы был рассчитан по формуле: t _1/2 = log 0,5 / (log A _e / A ₀ ) × t , где t _1/2 — половина — срок службы оцениваемого варианта HSA, A _e — это количество оставшегося HSA, A ₀ — это количество HSA в день 1, и t — это прошедшее время.

Двусторонний ELISA против HSA

Поликлональные козьи анти-HSA (1,0 мкг / мл) (Sigma-Aldrich) или моноклональные мышиные анти-HSA (1,0 мкг / мл) (Abcam), разведенные в PBS, были добавлены до 96%. планшеты ELISA (Costar) и инкубировали в течение ночи при 4 ° C. Лунки блокировали PBSM в течение ночи при 4 ° C, а затем трижды промывали PBST. Серийные разведения HSA (500,0–0,2 нг / мл) в PBSTM применяли параллельно с собранной ростовой средой, образцами HERA или плазмой с последующей инкубацией в течение 1 часа при комнатной температуре. Лунки трижды промывали PBST, прежде чем связанный HSA был обнаружен с использованием поликлональных антител к HSA, конъюгированных с щелочной фосфатазой, от коз (1: 3000) (Bethyl Laboratories, Inc.). Лунки трижды промывали PBST и затем проявляли п-нитропенилфосфатным субстратом (10 мкг / мл) (Sigma-Aldrich), разведенным в диэтаноламиновом буфере. Поглощение измеряли при 405 нм с использованием спектрофотометра Sunrise (TECAN).

ESI-MS и выделение L585X из плазмы человека

Пациент, включенный в исследование, испытал однократное острое событие панкреатита, индуцированного желчнокаменной болезнью. Образцы крови брали при поступлении в больницу, а затем — 2,2, 32,9, 35, 57,4 и 104.Через 3 ч после приема. Активность панкреатической амилазы и активность липазы измеряли на анализаторе Abbott c8000 / c16000 (Abbott Laboratories) в соответствии с протоколом производителя, используя контрольный диапазон 8–53 Ед / л и 10–70 Ед / л соответственно. Концентрацию общего сывороточного альбумина определяли методом связывания бромкрезолового зеленого (нормальный диапазон 35–50 г / л). Для количественного определения уровня L585X в крови 10 мкл плазмы инкубировали в течение 2 часов при 37 ° C с 0,5 мкл 150 мМ дитиотреитола. Затем 1,5 мкл смеси разделяли обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонке Phemomenix C-4 (25 × 0.46 см). Пик пика HSA собирали и 20 мкл непосредственно вводили в источник электрораспыления масс-спектрометра Platform II при скорости потока 10 мкл / мин. Данные были получены и обработаны с помощью MassLinks, а деконволюция — с помощью программного обеспечения Max-Ent. Период полураспада L585X был рассчитан по формуле: t _1/2 = log 0,5 / (log A _e / A ₀ ) × t , где t _1/2 — половина life of L585X, A _e — процентное содержание L585X в крови, A ₀ — процентное содержание L585X в крови 2.2 часа после поступления в больницу, а t — время, прошедшее с момента взятия пробы крови 2,2 часа.

HSA был изолирован от здорового контроля и от пациента с алкогольным панкреатитом, имеющим 100% L585X, с использованием хроматографии DEAE Sephadex с использованием 16 мМ буферов ацетата натрия с градиентом pH от 5,2 до 4,4 ³⁹ . Исследование проводилось в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и руководящими принципами Кентерберийских лабораторий здравоохранения по клиническим образцам.Пациенты дали письменное информированное согласие.

расщепление CPA

HSA WT, K573P или Tanzeum ^® (15 мкМ) в 1 × PBS инкубировали с CPA поджелудочной железы человека (30 мкг / мл) (Elastin Products Company, Inc.) в течение 5 ч при 37 ° C. с тряской.

ЖХ-МС / МС

ЖХ-МС / МС использовали для анализа образцов HSA, которые были инкубированы с или без CPA. Каждый образец (3 мкг) смешивали с 50 мМ NH ₄ HCO ₃ (pH 7,8) до объема 18 мкл. Для восстановления белка добавляли 2 мкл 100 мМ дитиотреитола и инкубировали в течение 30 минут при 56 ° C.Для алкилирования добавляли 5 мкл 55 мМ йодацетамида и инкубировали в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре. Для переваривания белка к каждому образцу добавляли трипсин (0,5 мкг) и инкубировали во влажной камере в течение ночи при 37 ° C. Затем образцы очищали на микроколонках C18: три диска собирали в наконечнике пипетки на 200 мкл и активировали 50 мкл MeOH, а затем 50 мкл ACN. Диски дважды уравновешивали 80 мкл 0,1% TFA перед добавлением образцов. Диски дважды промывали 80 мкл 0,1% FA перед тем, как образцы элюировали 80 мкл 80% ACN / 0.1% FA. Затем образцы центрифугировали в скоростном вакуумном концентраторе для удаления ACN, и объем доводили до 7 мкл, используя 0,1% FA. Таким образом, образцы разбавляли в семь раз, а затем хранили при -20 ° C до анализа. Образцы анализировали с использованием EASY-LC, соединенного с масс-спектрометром Q Exactive Quadrupole-Orbitrap (Thermo Fisher), с колонкой EASY Spray PepMap ^® RSLC (C18, 2 мкл, 100 Å, 75 мкм × 25 см) и температурой колонки. при 60 ° С. Использовали 60-минутный градиент и инъекции 3 мкл.

сырых файлов MS были отправлены в программу MaxQuant (версия 1.6.1.0) для идентификации белков и приблизительного количественного определения. Поиск был проведен против последовательностей WT HSA и L585X. Параметры были установлены следующим образом: карбамидометилирование как фиксированная модификация и N-ацетилирование белка и окисление метионина как переменные модификации. Окно первой ошибки поиска 20 ppm и ошибка поиска по сети 4,5 ppm. Использовали трипсин с двумя допустимыми ошибками расщепления. Количественную оценку проводили на уровне пептида путем сравнения интенсивности С-концевого пептида, лишенного L585, с интенсивностью соответствующего пептида WT в том же образце, без корреляции возможных различий в эффективности ионизации отдельных пептидов.

Последовательность и структурный анализ

Последовательности альбумина человека (AAA98797), орангутана (NP_001127106.2), шимпанзе (XP_517233.3), макаки (NP_001182578.1), панды (XM_002928492.3), слона (A ), лошадь (NP_001075972.1), осел (AAV28861), крупный рогатый скот (AAA51411), коза (ACF10391), овца (NP_001009376), свинья (AAA30988.1), собака (CAB64867.1), кошка (CAA59279.1), кролик (NP_001075813), опоссум (XM_001364821.2), хомяк (ABR68005.1), морская свинка (AAQ20088.1), крыса (AAH85359.1) и мышь (AAh59971) были загружены из Национального центра биотехнологической информации.Выравнивание производили с помощью программного обеспечения Clustalω.

Координаты кристаллической структуры HSA (PDB ID 1AO6) ³ и HSA в комплексе с hFcRn (PDB ID 4N0F) ²⁶ использовали и проверяли с помощью программного обеспечения PyMOL (Schrodinger Inc.).

Статистика и воспроизводимость

Статистический анализ данных, полученных с помощью HDX-MS, был выполнен с использованием программного обеспечения Excel (Microsoft). HDX выполняли с тремя повторностями каждого варианта альбумина для всех временных точек, за исключением образца 2960 мин, где n = 1.Для точек данных, выполненных в трех экземплярах, сравнительный анализ проводился либо с гомоскедастическим, либо с гетероскедастическим тестом Стьюдента t , в зависимости от равенства дисперсий сравниваемых точек данных. Равенство дисперсий определяли с помощью теста F с уровнем значимости 0,05. Считалось, что пептид имеет значительную разницу в HDX только в том случае, если одна из его точек данных удовлетворяет следующим двум критериям ⁷⁰ : (1) значительная разница в поглощении дейтерия ( p <0.2} \) = 0,13D) (дополнительный рис. 7). Для последней временной точки (2960 мин), для которой не были получены повторяющиеся данные, статистическую значимость определяли, если изменение превышало 99% доверительный интервал (± 0,26 D), следуя методу, описанному Houde et al. и Arora et al. ^71,72 . Этот 99% доверительный предел был оценен по 385 единичным измерениям стандартных отклонений для каждого состояния белка.

Статистический анализ данных, полученных с помощью HERA, и измерений периода полужизни у мышей выполняли с использованием GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc.). Эксперимент HERA проводили трижды, каждый раз добавляя по три лунки для каждого варианта альбумина. Измерения периода полужизни выполняли один раз на мышах Tg32-Alb ^{— / —} и один раз на мышах Tg32, куда были включены четыре и пять мышей на один вариант альбумина, соответственно. Статистическую значимость оценивали с помощью непарного теста Стьюдента t (с уровнем достоверности 95% и двусторонним p <0,05, определяемым как значимое различие).

Сводка отчетов

Дополнительная информация о дизайне исследований доступна в Сводке отчетов по исследованиям природы, связанной с этой статьей.

Подход, подчеркивающий различия в локальной гидрофильности

Различия в первичной структуре HSA и BSA

Теперь мы сосредоточимся на определении молекулярного происхождения различий, происходящих от DEER, между структурами раствора BSA и HSA. С этой целью мы тщательно изучаем первичные аминокислотные последовательности обоих белков, особенно различия в их индивидуальной гидрофобности. Поскольку локальные термодинамические величины являются ключевыми величинами любого исследования биохимических процессов в растворе, гидрофильность и гидрофобность являются очень важными параметрами, описывающими взаимодействия между растворителем (для белков, по сути, водой) и растворенным веществом [38].Биохимические причины аминокислотных различий могут быть самыми разными, помимо эволюционных различий, например Доступность определенных питательных веществ может играть роль, которая, как предполагалось, ведет к эпигенетическому образованию аллоальбуминов между отдельными видами [30].

В настоящее время используется множество различных методов оценки гидрофобных участков белков, например потенциал молекулярной гидрофобности, MHP [31], [32]. Мы проконсультировались с четырьмя довольно простыми шкалами гидропатии независимого происхождения, чтобы получить количественный анализ различий в гидрофобности / гидрофильности BSA и HSA.Мы придерживаемся шкал Engelman et al. (GES) [39], Eisenberg et al. (ES) [40], Надери-Манеш и др. (Нью-Мексико) [41] и Кайт и Дулиттл (К.Д.) [42].

Мы подробно сравнили кросс-корреляции между этими четырьмя шкалами в вспомогательной информации S1 и обнаружили линейную зависимость между шкалами, которую можно количественно выразить с помощью значения r Пирсона, которое во всех случаях составляет> ± 0,85 (Таблица S1 , Рис. S7). Таким образом, все шкалы гидропатии сильно коррелированы друг с другом, хотя имеют разные теоретические и экспериментальные основы.

После доказательства того, что все четыре шкалы гидропатии по существу и количественно приводят к одним и тем же результатам, и поэтому для следующего обсуждения мы в основном обсуждаем различия BSA-HSA с точки зрения шкалы гидропатии Kyte & Doolittle, которая является наиболее часто используемой и простой. , но интуитивно понятная шкала для термодинамической характеристики аминокислот. В частности, индекс гидропатии (HI) по шкале Kyte & Doolittle описывает изменение энергии Гиббса при воздействии воды на аминокислоту из чисто гидрофобной среды.Следовательно, отрицательные значения гидропатии обозначают полярные и сильно связывающие водород аминокислоты, а положительные значения обозначают гидрофобные аминокислоты. Мы сравнили каждую конгруэнтную аминокислоту HSA и BSA (т.е. диапазон окна по Кайту и Дулитлу равен 1), чтобы получить результирующую разницу в чистом индексе гидропатии ΔHI путем вычитания соответствующих значений (см. Уравнение S1). Это позволяет акцентировать внимание на различиях и дополнительно снижает шумные масштабы. Положительные значения ΔHI можно интерпретировать как гидрофобные, а отрицательные — как гидрофильные сдвиги в HSA.При необходимости мы также сравниваем действующие аминокислоты и их гидропатии одну за другой (рис. S5 – S6). Обратите внимание, что шкала гидропатии KD часто используется для мембраносвязанных белков [42], [43] с диапазоном окон от 7 до 20 аминокислот.

Мы подробно исследуем индивидуальные остатки и не усредняем гидропатии с использованием больших окон. Подробное объяснение этого обращения можно найти во вспомогательной информации S1.

Обратите внимание, что здесь мы просто пытаемся соотнести различия гидропатии и положения в кристаллической структуре с наблюдаемыми расхождениями в структурах наших растворов.

В целом, HSA (общая гидропатия Ω _HSA = −230,8, см. Уравнение S2) имеет на 48,4 балла больше гидропатии по сравнению с BSA (Ω _BSA = −279,2) и, таким образом, HSA в целом должен быть более гидрофобным. Эту тенденцию можно подтвердить по всем остальным 3 шкалам (баллы избыточной гидропатии HSA: GES: 9,4; ES: 16,8; NM: 34,8), когда они нормированы на KD (Таблица S2). Примечательно, что при изучении различных положений остатков становится очевидным, что эти отклонения не распределяются равномерно по всей последовательности, а возникают скорее сгруппированными (см.рис.S4). Аналогичное наблюдение было также сделано Billeter et al. [44] при сравнении структур прионных белков у разных видов млекопитающих.

Многие различия альбумина проявляются даже в остатках, которые находятся на поверхности, что важно, если иметь в виду, что HSA можно считать менее гидрофильным, чем BSA, о чем свидетельствует их Ω _x . Не претендуя на полноту, мы явно идентифицировали четыре региона, которые представляют большой интерес по структуре и функциям, которые демонстрируют накопление аминокислотных различий и экстремумов ΔHI между BSA и HSA: пересечение между субдоменами IB и IIIA, расположенными заметно в в центре белка — открытая поверхность петли в субдомене IIB и два сайта связывания FA, обычно называемые сайтами 2,4 и 5 [45].Эти области показаны на рис. 4. Интересно, что Majorek et al. [35] обнаружили очень похожие области во время идентификации эпитопов антител для иммунологических исследований бычьего (BSA), лошади (ESA) и сывороточного альбумина кролика (RSA). Таким образом, не будет надуманным предположить, что эти области обладают особой функциональностью в сочетании с водной средой для любого лиганда, который должен быть связан с альбумином.

Теперь мы дополнительно описываем эти области и подробно сообщаем о различиях между BSA и HSA с точки зрения индекса гидропатии KD.Обратите внимание, что на рисунках 5-8 мы тем не менее представляем различия в гидропатии для всех четырех протестированных шкал гидропатии, чтобы прояснить, что наше обсуждение не привязано к выбранному индексу гидропатии. На рис. 5 показана область между субдоменами IB и IIIA, доступная для растворителя. За исключением одного аргинина, HSA и BSA различаются по аминокислотной последовательности по всей спирали между остатками 182 и 191 в IB, хотя образуют эквивалентный массив спиралей, как предположили Kabsch и Sander [46]. В то время как остатки 182, 185, 188, 189, 195 и 199 недоступны для растворителя, остатки 184, 190 и 191 подвергаются действию растворителя и доступны из воды.Было обнаружено, что ΔHI между обоими белками очень высока в этой области; HSA, по-видимому, обладает чрезвычайно сильными гидрофильными свойствами, в то время как BSA сильно гидрофобен по аналогичным остаткам 189 и 190.

Рисунок 5. Область пересечения.

( A ) Область пересечения между субдоменами IB и IIIA HSA со связанной стеариновой кислотой (pdb-ID: 1e7i). Идентичные аминокислоты в HSA и BSA окрашены в синий цвет, разные аминокислоты — в красный цвет. ( B ) График ΔHI для остатков 180–200 и 452–460.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045681.g005

Рисунок 6. Область петли.

( A ) Субдомен IIB HSA со связанными стеариновыми кислотами (pdb-ID: 1e7i). Идентичные аминокислоты в HSA и BSA окрашены в синий цвет, разные аминокислоты — в красный цвет. ( B ) График ΔHI для остатков 297–320 и 351–380.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045681.g006

Рисунок 7. Сайт 1.

( A ) Сайт 1 в субдомене IB в HSA со связанными стеариновыми кислотами (pdb-ID: 1e7i) ).Идентичные аминокислоты в HSA и BSA окрашены в синий цвет, разные аминокислоты — в красный цвет. ( B ) График ΔHI для остатков 119–136 и 154–168.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045681.g007

Рисунок 8. Сайт 5.

( A ) Сайт 5 в субдомене IIIB в HSA со связанной стеариновой кислотой (pdb-ID: 1e7i). Идентичные аминокислоты в HSA и BSA окрашены в синий цвет, разные аминокислоты — в красный цвет. ( B ) График ΔHI для остатков 498–509 и 560–580.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045681.g008

Если внимательно присмотреться, остаток 190 (K = -3,9) в HSA соответствует L = 3,8 в BSA. Это указывает на то, что эти домены могут иметь различную гибкость в соответствии с теорией Лам-Чандлера-Уикса (LCW-) [7]. Таким образом, их взаимодействия с водой явно различаются, что можно объяснить иммобилизацией двух доменов в BSA между гидрофобными остатками 455 (L) и 456 (I) и противоположными сегментами 189 (V) и 190 (L).В HSA эта область может просто оставаться доступной для воды из-за сильно гидрофильных остатков, а также может рассматриваться как указание на «настройку» топологии локальной структуры раствора с помощью воды. Кроме того, остаток 189 варьируется от G (-0,4) в HSA до более гидрофобного V (4,2) в BSA. Следовательно, BSA может создавать зону высыхания фазового перехода, которая снижает плотность воды между обоими доменами.

Последовательность, принадлежащая спирали от 455 до 457 в домене III B, также различается по составу, но в обоих белках ее можно рассматривать как чрезвычайно гидрофобную.В целом, учитывая заметное междоменное положение, гибкость настройки и взаимодействие с водой в этой точке вполне могут вызвать структурные различия в более крупном масштабе топологии.

Другой представляющий интерес сайт обнаружен в субдомене IIB, где обнаружены значительные аминокислотные различия между BSA и HSA (см. Фиг. 6). Петля между 295 и 312 подвергается воздействию растворителя, а остатки 297 и 300 показывают большие отклонения от гидропатии. HSA имеет набор более гидрофобных остатков от 300 до 320 по сравнению с соответствующими остатками в BSA.Другие существенные различия альбумина находятся в непосредственной близости от этой петли и расположены на противоположной петле, подверженной воздействию растворителя, в диапазоне от остатков 360 до 376. Существует сильный гидрофобный сдвиг в сторону HSA на остатках 363 и 364. Эти аминокислоты находятся прямо на кончик указывает в объем воды. Гипотетически подвергая эту область воздействию воды, можно было представить, что она перевернется внутри белка и изменит форму белка, потенциально становясь немного более глобулярным.

Будучи соединенными с несколькими спиралями в HSA, можно предположить, что перестройки в этих заметно открытых петлях, которые обладают высокой степенью свободы движения, оказывают значительное влияние на третичную структуру. Обратите внимание, что очень похожие наблюдения были сделаны для кальмодулина и тропонина C [28], и такой аргумент также подтверждается Kim et al. [47], которые с помощью методов ЭПР обнаружили, что влияние растворенных веществ на конформационную выборку петель может приводить к более компактной (глобулярной) форме транспортеров наружной мембраны.В отличие от HSA, BSA (по крайней мере, без жирных кислот) очень вероятно подвергает эту область воздействию воды, имея набор сильно гидрофильных остатков от положения 363 до 367 (K, D, D, P, H) и от 311 до 323. на противоположной петле. Интересный взгляд на противоположные гидрофильные остатки был дан Бен Наимом [4], который утверждает, что молекулы воды могут сшивать два домена, образуя двойные водородные мосты между ними. Такое доменное соединение и лучшее включение этих петель в сеть водородных связей для BSA может вместе привести к снижению конформационной гибкости в этой решающей точке.

На фиг. 7 показан один из сайтов связывания жирных кислот, обычно обозначаемый как сайт 1. Он расположен в центре четырехспирального пучка субдомена IB. Этот сайт доступен для платежеспособности. Положения конгруэнтных аминокислот в HSA снова более гидрофобны по сравнению с BSA. Точнее, все значительно более гидрофобные остатки 120, 122, 126 в HSA расположены на небольшой открытой спирали. Положения 156 и 157 также в значительной степени гидрофобны в HSA, в то время как следующие четыре остатка из положений 159–162 являются чрезвычайно гидрофильными в обоих белках.Обратите внимание, что только две аминокислоты идентичны в диапазоне от 156 до 164 (Y и A, см. SI Рис. S5 и S6). Это может указывать на различие в том, как связываются ЖК в двух белках. Форма связывающего кармана может быть изменена, и экспозиция воды может быть настроена аналогично механизму, который можно предположить для субдомена IIB (рис. 6).

В случае сайта связывания жирных кислот 5 (см. Фиг. 8) наблюдаемая до сих пор картина, согласно которой HSA обычно более гидрофобна в отношении остатков, экспонированных растворителем, фактически инвертирована.

HSA имеет сильно гидрофильные остатки от 560 до 577 по сравнению с остатками BSA. Сайт связывания 5 можно найти в гидрофобном канале субдомена IIIB. За исключением остатка 579, все аминокислоты в этой области подвергаются воздействию растворителя, а остаток 570 имеет очень сильное значение ΔHI -7,7 между HSA (E = -3,5) и BSA (V = 4,2). Он расположен далеко от точки входа в ТВС, но отмечает переход от спиральной к петлевой области, которая может управлять движением спиралей, образующих вход в ТВС.Вокруг сайта связывания 5 оба белка могут иметь явно разные конформации раствора, так как остаток 560, расположенный на другом конце этой петли, может способствовать формированию шарнирной задачи в HSA. При сравнении кристаллических структур HSA 1e7i с 1BM0 (со связанными FA и без них), именно участок 5 физически сдвигается примерно на полнанометра, когда связаны длинные цепочки FA [27].

Противоположная сторона точки входа связывающего канала образована петлей из остатков с 501 по 506, которые все открыты на поверхности.ΔHI резко меняется от остатка 501, где заряженная, сильно гидрофильная глутаминовая кислота в HSA сочетается с нейтральным, слегка гидрофобным аланином в BSA (E _HSA -A _BSA = -5,3) до остатка 504, где это инвертировано ( A _HSA -E _BSA = 5,3) и в остатке 506, где треонин в HSA с довольно нейтральным HI соответствует сильно гидрофобному лейцину в BSA (T _HSA -L _BSA = -4,5). В HSA этот полный ряд аминокислот чередуется между гидрофильными и гидрофобными, тогда как в BSA эта петля в целом гораздо более гидрофобна (см.рис.S5 C ). Следовательно, взаимодействие с водой поверхностной области сайта 5 в HSA явно отличается от взаимодействия в BSA. Для HSA область спирали 570–580 явно более гидрофильна, чем для BSA, т.е. также лучше «заякорена» в сети Н-связей.

Рассуждая о молекулярном механизме связывания FA, противоположная область петли может играть решающую роль, будучи перевернутой внутрь (закрытая) или наружу, подвергаясь воздействию растворителя (открытая). BSA также явно более гидрофобен в области петли, в то время как HSA снова дополняет интересный, чередующийся образец сильно гидрофильных и гидрофобных аминокислот.Этот паттерн — который, как можно предположить, не имеет сильной энергетической и энтропийной склонности ни подвергаться воздействию воды, ни быть похороненным — может снова трансформироваться в большую конформационную гибкость [48] и адаптивность в HSA.

Корреляция различий в первичных структурах, кристаллических структурах и структурах раствора

Несмотря на схожую первичную структуру BSA и HSA, наши экспериментальные результаты DEER — насколько нам известно впервые — показывают, что BSA является довольно жестким в растворе и явно отличается по своей функциональной структуре от HSA на наноуровне.Мы идентифицировали четыре области в обоих белках (не обязательно полные), которые содержат сильно различающиеся аминокислоты. Хотя мы не можем напрямую проследить очевидное различие между структурами растворов BSA и HSA до различий в гидропатиях, мы можем правдоподобно утверждать, что кластерные различия аминокислот вполне могут привести к серьезным изменениям в структуре при воздействии воды, как это наблюдалось. для других белков ранее [10], [28].

Поразительно, что сходство аминокислотной последовательности и кристаллической структуры между HSA и BSA отражено в структуре раствора BSA.В нашем «крупнозернистом» обзоре связанных ЖК мы находим отчетливую картину из трех пиков, сильно напоминающую распределение ЖК в кристаллической структуре HSA. Поскольку в настоящее время для BSA не существует кристаллической структуры, содержащей FA, можно сделать вывод, что кристаллическая структура HSA, которая, скорее всего, описывает конформацию, близкую к минимуму поверхности потенциальной энергии, является очень хорошим описанием энергетического минимума в загруженных FA. BSA тоже. Основываясь на наших результатах DEER, можно правдоподобно предположить, что в растворе HSA, в отличие от BSA, приобретает гораздо большую конформационную гибкость, а в общем конформационном ансамбле HSA гораздо более симметричная поверхность подвергается воздействию потенциальных лигандов для транспортировки.Кажется, что BSA не обладает такой гибкостью на поверхности, что на самом деле может влиять на функцию белка. Следует отметить, что хотя белки со схожими функциями у разных видов могут иметь сходные кристаллические структуры [49], их функциональные свойства в растворе могут существенно различаться. Это было, например, подтверждено недавними исследованиями, показывающими, что вода, взаимодействуя с растворенными веществами, может сильно влиять на функциональные свойства [6]. Непосредственная близость воды к протяженным поверхностям с гидрофобными свойствами энергетически невыгодна, поскольку сети водородных связей больше не могут поддерживаться.В результате плотность воды снижается вблизи гидрофобной поверхности, что приводит к переходу к высыханию, не в последнюю очередь в зависимости от масштаба [6], [7], [38]. Кроме того, мы недавно показали, что даже метильные группы метанола в смесях вода-метанол окружают небольшие неорганические дисульфонаты, так что они меньше всего нарушают сеть водородных связей [50].

Kabsch и Sander [46] очень четко объяснили, что гомологии аминокислотных последовательностей в белках не обязательно обнаруживают функциональные отношения между ними.Более того, гомологи последовательностей не обязательно должны иметь идентичные конформации в своих кристаллических структурах. Как видно из сравнения структур HSA и BSA (pdb-IDs 1BM0 и 3v03, соответственно), 75,52% гомологии последовательностей, с другой стороны, могут давать почти идентичные трехмерные кристаллические структуры (см. Рис. 4), что подтверждает, что Порог трехмерной структурной гомологии для белков длиннее 80 остатков дает аналогичные структуры уже для 25% соответствия последовательности [51]. Эти аминокислотные различия, следовательно, не очень сильно изменяют энергетически минимизированное состояние, лишенное воды.Мы определили, что многие различия аминокислотных последовательностей сгруппированы в определенных областях белка, которые могут очень сильно влиять на связывание FA (сайты связывания 1 и 5) или даже на глобальную структуру (центральный интерфейс между субдоменами IB и IIIA и участками петель). в поддомене IIB). Например, кажущаяся жесткость, наблюдаемая в BSA, может быть аккредитована, по крайней мере частично, с гидропатическим «замком» в заметной области пересечения между субдоменами IB и IIIA (см. Рис. 5), в то время как в HSA вода может быть способна проникать более глубоко. проникнуть в эту область пересечения.Кроме того, область петли на конце субдомена IIB настолько сильно экспонируется водой и одновременно связывает длинные области спирали, что даже небольшие изменения гидрофобности (HSA, подвергающий несколько гидрофобных аминокислот воздействию воды) могут хорошо повысить структурную подвижность и прямые структурные изменения на кажущихся отдаленных участках. регионы аллостерическими эффектами. Судя по нашим измерениям функциональных структур в растворе, полученным с помощью DEER, эти различия, следовательно, кажутся скорее коррелированными с конкретными модификациями для настройки формы, гибкости, адаптивности и связывающей способности белка путем взаимодействия с окружающими молекулами растворителя и влияния на колебания. по плотности воды [5] — [7].

Существует очень интересный недавний подход к ядерному магнитному резонансу (ЯМР) от Nucci et al. [10] с использованием отношения NOE / ROE в ЯМР и инкапсуляции обратной мицеллы для мониторинга гидратации белка. Авторы обнаружили, что по всей поверхности белка есть области кластеров гидратации с сильно различающейся динамикой, что можно рассматривать как свидетельство того, что вода играет главную роль в изменении функций белка, таких как формирование, складывание, стабильность и динамика. Используя ¹³ C-ЯМР, Marlow et al.[48] ​​пошли еще дальше и связали гидрофобный эффект с конформационной энтропией, которая, как предполагается, играет ключевую роль в связывании лиганда. Наши выводы для конкретных участков, касающиеся местных значений гидропатии и крупнозернистой (основанной на ЭПР) структурной информации, позволяют прийти к аналогичным выводам. Путем сравнения аффинности связывания бромкрезолового зеленого (БЦЖ) различных сывороточных альбуминов млекопитающих [15] было обнаружено, что обмен только одной аминокислоты в области связывающего кармана, как показано с аллоальбуминами макаки-резуса, может дать существу эволюционное преимущество [15]. 30], или делает выбор между физиологически активными белками или их патологическим накоплением амилоидных фибрилл в ткани [52] — [54].Деполяризация фосфоресценции использовалась для понимания взаимосвязи между структурой раствора и кристаллической структурой HSA и BSA. Было обнаружено, что общая конформация в нейтральном растворе БСА очень похожа на сердцевидную структуру, наблюдаемую в кристалле ЧСА [12]. Вот что мы сейчас видим в деталях: поверхность BSA, зондированная 16-DSA, отражает кристаллическую структуру HSA. Напротив, мы показываем, что структура раствора HSA, исследованного с помощью 16-DSA, отличается от его кристаллической структуры.

Принимая во внимание, что переходные зоны высыхания возникают рядом с гидрофобными остатками [7], выраженная конформационная гибкость на поверхности HSA вполне может быть коррелирована с отсутствием энергетически выгодных взаимодействий с водой.Это количественно выражается и отражается в сумме избыточной чистой гидропатии 48,4 (Ω _{кД, HSA} — Ω _{кД, BSA} ) по сравнению с BSA, что означает, что HSA значительно менее гидрофильный. Обратите внимание, что локально многие из этих в целом различных, более гидрофобных сайтов в HSA явно подвержены воздействию воды. Можно предположить, что, подвергая воздействию большего количества гидрофобных аминокислот, HSA может лучше привлекать и предварительно связывать гидрофобные или амфифильные лиганды, такие как ЖК. Кроме того, менее индивидуальные благоприятные взаимодействия с водой (см.рис.6 и 7) в решающих точках или коротких последовательностях и меньшая степень интеграции в водородную сеть водородных связей может рассматриваться как снижение общей третичной структурной стабильности белка, что может вынудить HSA отбирать большее конформационное пространство и локально проявлять много повышенная гибкость. Согласно теории LCW [7], гибкость в наших терминах также может быть описана как плотность воды и, таким образом, снижение вязкости на гидрофобных поверхностях, что, конечно, приводит к увеличению среднеквадратичного смещения гидрофобных остатков, которые могут e.г. описываться простым и хорошо известным уравнением Стокса-Эйнштейна [55]. Все эти локальные изменения могут затем глобально складываться в структуру раствора, которая сильно отклоняется от соответствующей кристаллической структуры и которая может даже считаться специализированной для различных функциональных возможностей. В случае альбуминов, показанных в этом исследовании, этими функциональными особенностями являются образование, расположение, сродство и гибкость сайтов связывания для лигандов с низкой полярностью / гидрофильностью, таких как ЖК.

Что такое аминокислоты? | Улучшение жизни с помощью аминокислот | О нас | Глобальный веб-сайт Ajinomoto Group

Аминокислоты — незаменимые соединения, общие для всех живых существ, от микробов до людей.
Все живые тела содержат одинаковые 20 типов аминокислот.

Какие аминокислоты актуальны в организме человека?

Аминокислоты составляют около 20% нашего тела или около 50% нашей твердой массы тела; они являются следующим по величине компонентом нашего тела после воды. В организме человека весом 50 кг содержится около 10 кг аминокислот.

Аминокислоты являются строительными блоками белков. Существует 100 000 типов белков, которые состоят всего из 20 аминокислот.

Двадцать типов аминокислот составляют белки человеческого тела.

Что такое незаменимые аминокислоты?

Из 20 аминокислот 9 аминокислот не могут быть синтезированы в нашем организме, и мы должны получать их с пищей. Они называются незаменимыми или незаменимыми аминокислотами .
Незаменимые аминокислоты: гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан и валин.

Что такое незаменимые аминокислоты?

11 оставшихся аминокислот могут быть синтезированы из других аминокислот в организме и, таким образом, называются несущественными (или заменяемыми) аминокислотами .
Незаменимые аминокислоты: аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глутаминовая кислота, глутамин, глицин, пролин, серин и тирозин. Однако как незаменимые, так и заменимые аминокислоты играют важную роль в поддержании нашей жизни.

Что такое условно незаменимые аминокислоты?

Некоторые заменимые аминокислоты (например, аргинин, цистеин и тирозин) называются полунезаменимыми или условно незаменимыми аминокислотами , потому что они имеют тенденцию иссякать в младенчестве или в таких состояниях здоровья, как болезнь, травма или после хирургия.

Подробнее о каждой аминокислоте здесь ：

Какова роль аминокислот в организме человека?

Аминокислоты, которые соединяются вместе, чтобы образовать белки, не только составляют наш организм, но также регулируют большинство основных функций нашего тела. Некоторые распространенные примеры белков — коллаген, кератин, гемоглобин и т. Д.

Аминокислоты также регулируют и поддерживают наш организм, превращаясь в ферменты или гормоны. Некоторые общеизвестные гормоны: щитовидная железа, инсулин, адреналин и т. Д.

Еще одна важная функция аминокислот — снабжать организм энергией. Как правило, здоровое тело со средней диетой использует углеводы в качестве основного источника топлива, но белки и аминокислоты могут использоваться в качестве последнего средства, когда основные источники истощаются из-за строгих упражнений.

Аминокислоты также играют важную роль во вкусовых качествах пищи. Белки не имеют особого вкуса, но каждая аминокислота имеет свой вкус, и их сочетание является одним из важных факторов, определяющих вкус пищи.Наиболее известной аминокислотой является глутаминовая кислота, которая отвечает за пятый вкус умами, а также является сырьем для приправы умами AJI-NO-MOTO®.

Поскольку наш организм не может производить все аминокислоты, мы должны потреблять некоторые необходимые аминокислоты с пищей из различных продуктов. Сбалансированная диета с необходимыми аминокислотами очень важна для правильного функционирования организма.

Какова роль аминокислот в сбалансированном питании?

Сбалансированное питание важно для здорового образа жизни.Необходимо сбалансированно получать 5 основных питательных веществ (белки, жиры и углеводы, а также витамины и минералы). Требуемое суточное потребление этих питательных веществ установлено Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) и во многих странах. Если этот баланс нарушен, например, при чрезмерном потреблении любого отдельного питательного вещества, увеличивается риск ожирения и заболеваний, связанных с образом жизни.

Точно так же требуемые количества 9 незаменимых аминокислот для нашего организма определены международными организациями (FAO / WHO / UNU).Это называется схемами оценки аминокислот. Если аминокислота меньше, чем в схеме оценки аминокислот, она называется ограничивающей аминокислотой. Пищевая ценность белка может быть улучшена путем добавления ограничивающей аминокислоты. Оценка аминокислот — это числовое значение, показывающее, насколько наименьшая ограничивающая аминокислота удовлетворяет схеме оценки. Можно сказать, что белок с оценкой аминокислот, близкой к 100, является белком хорошего качества.

В целом животные белки, такие как яйца, являются белками хорошего качества с высоким содержанием аминокислот.С другой стороны, известно, что количество растительных белков, таких как пшеница и кукуруза, низкое.

Понимание баланса аминокислот в белке с помощью теории ствола

Для здорового образа жизни очень важно придерживаться диеты с правильным балансом высококачественных белков; а именно незаменимые аминокислоты, которые организм не производит. Если аминокислоты попадают в организм в правильном соотношении, организм может эффективно их использовать, и будет выводиться меньше отходов. Предлагается необходимая суточная доза каждой из девяти незаменимых аминокислот.

Баланс незаменимых аминокислот в пище часто изображают в виде деревянной бочки, которую используют для наполнения водой. Каждая доска ствола представляет каждый тип незаменимых аминокислот в пище. У корма с идеальным балансом аминокислот, такого как яйцо, есть бочонок, каждая доска которого аккуратно образует линию на одной высоте. Однако в случае пшеницы доски различаются по высоте. Если одна из досок короче других, вы можете заполнить бочку только до самой нижней доски, а вода за ее пределами будет вытекать из бочки.Точно так же, если отсутствует хотя бы одна незаменимая аминокислота, остальные аминокислоты не могут использоваться эффективно.

Итак, что произойдет, если аминокислоты лизин, которого недостаточно для пшеницы, будет добавлен извне в бочку для пшеницы? Было обнаружено, что доска для лизина становится выше, что позволяет более эффективно использовать другие типы аминокислот.

Эта теория была использована для улучшения питания во многих странах с плохим питанием, способствуя решению социальных проблем.Например, многие страны Африки страдают от плохого развития младенцев из-за недостаточности питания, что приводит к высокому уровню смертности.

* Коко, каша из ферментированной кукурузы, является традиционным дополнительным блюдом в Гане. Однако уровень белка (аминокислотный баланс) в коко не соответствует требованиям ВОЗ в питательных веществах и диетическим рекомендациям.
Чтобы восполнить этот дефицит питательных веществ, Ajinomoto Group в сотрудничестве с различными партнерами разработала KOKO Plus, добавку, содержащую аминокислоты и соевые белки, которые при добавлении в коко во время приготовления пищи обеспечивают достаточное количество питательных веществ, таких как сбалансированный белок, а также кальций, железо. , Цинк, йод, фолиевая кислота, витамины A, B1, B2, B6, ниацин, K1, D3, B12 для детей.Всемирная продовольственная программа (ВПП) проверила эффективность КОКО Плюс и зарегистрировала его как «Питательный порошок» в своей продовольственной корзине в феврале 2018 года.

* Проект «Коко Плюс» в Гане был передан Фонду Аджиномото с 2017 г.

В нашем повседневном рационе продукты с высоким содержанием лизина включают молочные продукты, яйца, мясо, рыбу и бобы, тогда как рис содержит недостаточное количество лизина. Таким образом, идеально сочетать бобовые продукты, такие как мисо и тофу, с рисом, чтобы обеспечить потребление всех незаменимых аминокислот.Осознанное питание с учетом правильного баланса аминокислот очень важно для более здорового образа жизни.

Группа Ajinomoto поддерживает здоровый образ жизни людей во всем мире, раскрывая силу аминокислот. Узнайте больше о нашем подходе к питанию здесь.

Контент, который может вам понравиться

Аминокислоты для улучшения спортивных результатов

При правильном использовании аминокислоты могут помочь в укреплении мышц и восстановлении, повысить выносливость и более эффективно наращивать мышечную массу.Идеально подходит для занятий спортом и …